谈枳壳甘草汤对腰椎间盘突出模型大鼠炎症及退变的影响
谈枳壳甘草汤对腰椎间盘突出模型大鼠炎症及退变的影响 腰椎间盘突出症(LDH)是脊柱外科疾病中发病率最高的一种疾病， 一个 人一生中发生下腰痛的概率大约是80%，而其中20%～30%是因LDH 引起的。其 中炎症介质在神经根病变中起着重要的作用， 炎症介质可以诱使人体的神经纤 维组织产生炎性变化、超敏化及神经纤维的脱髓鞘改变;这些炎症介质还使得神 经根及相邻部位的神经纤维感受器处于兴奋状态。从而成为LDH 神经根性疼痛 的重要原因之一。1990 年Saal 等在LDH 患者手术摘除的髓核中，发现磷酯酶 A2(PLA2)活性显著升高，证实了椎间盘组织中PLA2炎症介质的存在。随后炎症 介质在临床中引起人们的注意。1995 年Ozaktay 等通过实验在兔子腰关节囊及 附近组织中注入PLA2，解剖后发现注射部位出现了炎症及神经毒性反应， 说明 在突出的椎间盘髓核中PLA2 具有高度引起局部炎症的特性。现代有研究表明， 当人体的椎间盘发生退变时，可在退变的组织中检测到多种炎症细胞因子， 如 肿瘤坏死因子- (TNF-)、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)等。而TNF 是在炎症产 生中最早出现和起到重要作用的炎症介质。
TNF 可诱发机体产生中性粒细胞及淋巴细胞， 并能促进其他炎性细胞因 子的聚集和分泌。这些炎症介质可引起细胞的毒性作用，从而释放过氧化物酶、 NO 等物质。这些物质会导致软骨终板细胞的损害，使得椎间盘软骨细胞溶酶体 丧失稳定性， 进而导致细胞膜脂类代谢、糖代谢发生紊乱，最终引起软骨终板 细胞出现坏死和钙化， 这种变化会使退变的椎间盘产生严重的营养障碍， 从而 加速椎间盘组织的退变步伐。本实验通过观察枳壳甘草汤对大鼠腰椎间盘突出模 型髓核中PLA2 活性及其对IL-6、TNF- 的影响，为枳壳甘草汤提供实验依据。
现报告如下。
1 材料与方法 1.1 实验 动物选取3 月龄SPF 级SD 雄性大鼠90只，体质量(20020) g，由苏州市中 药研究所提供。动物实验环境：清洁级，温度控制在22 ℃左右，湿度在65%左 右。实验过程中完全符合《关于善待实验动物的指导性意见》标准。
1.2 药物 与试剂中药饮片：枳壳甘草汤组成为枳壳10 g，甘草6 g，当归10 g， 丹参10 g， 三棱10 g， 莪术10 g， 牵牛子丑5 g ( 枳壳批号为20150202;
甘草批号 为20150123;
当归批号为20150321;
丹参批号为201500821;
三棱批号为 20150530;
莪术批号为20150309;牵牛子批号为201500409，均购自苏州春晖堂饮 片厂)。加冷水500 mL，浸泡30 min，煮沸后煎30 min，取汁200 mL;再加水300 mL， 煎30 min，取汁200 mL，两次相兑，并浓缩成1.5 g/mL 煎剂，保存于恒温冰箱中 备用。吲哚美辛胶囊(25 mg/粒，苏州第三制药厂有限责任公司，批号：
150409);PLA2 Elisa 测定试剂盒(批号：201601，南京建成生物科技有限公司);戊 巴比妥钠(批号：101087，Sigma 公司);注射用青霉素G 钠(0.48 g，80 万U，山 东鲁抗医药股份有限公司);红霉素软膏(0.5%，批号：150107，新乡华青药业有限 公司);TNF-(货号Sc-374433， Santa 公司);IL-6(货号Sc-1265，Santa 公司);抗兔/ 鼠通用型免疫组化试剂盒(货号：K5007，Dako Denmark A/S 公司);血清(驴血 清)(目录号：MP-7401，VECTOR-LAB 公司)。
1.3 主要仪器 Labsystems Finnpipette 100 L 单道移液器(南京建成生物科技有限公 司);Thermo 50L 8道移液器(南京建成生物科技有限公司);HH-4 数显恒温水浴锅 (国华电器有限公司);华东电子DG5033A酶标仪(南京华东电子集团医疗装备有限 责任公司)。
1.4 模型制备 1)椎间盘的获取：将SD 雄性大鼠90 只，体质量(20020) g，经2%戊巴比 妥钠(30 mg/kg) 腹腔注射麻醉并固定大鼠四肢， 用组织剪剃除大鼠背部体毛。
常规消毒后铺无菌单，并用橡皮筋扎紧大鼠尾部。操作员在无菌环境下每只大鼠 取第3、4 尾椎的椎间盘两个(椎间盘包括上下软骨终板)。取出的椎间盘采用10 mL 针头刺破椎间盘正中的纤维环，暴露出髓核，从而造成成破裂形态，放在生 理盐水中备用。
2)椎间盘的埋植：碘伏常规消毒背部，取后背正中切口，以L5 棘突为中 心，长约2 cm，切开皮肤、肌肉、将椎间盘植入肌肉层，随后逐层缝合，肌肉注 射青霉素钠80 万U， 伤口处涂以红霉素眼膏。后将大鼠放入笼中常规饲养。
3)术后管理：造模成功，待大鼠麻醉苏醒后，放置饲养笼中，22 ℃温室 饲养。术后5 d 连续使用青霉素钠80 万U 肌肉注射预防感染。1.5 分组及给药 将90 只SD 雄性大鼠采用随机数字表法，随机分为3 组，每组30 只，即 模型组、中药组(枳壳甘草汤)、西药组(吲哚美辛)。分组后，根据人和动物体表 面积折算的等效剂量比率表 计算得出给药剂量后灌胃给药。中药组予枳壳甘草 汤煎剂9.1 mL/kg，造模前1 h 灌胃给药，造模后灌胃，每日1 次，共5 d。西药 组予吲哚美辛7.5 mg/kg， 造模前1 h 灌胃给药，造模后灌胃，每日1 次，共5 d。
模型组予0.9%氯化钠注射液灌胃，按照与中药相同剂量和方法给药。
1.6 观察项目 1)髓核中PLA2 活性：于术后7、14、28 d 各组分别取6 个移植髓核标本， -80 ℃下保存。样本在60 ℃水浴30 min 后冷却，置4 ℃冰箱备用，取2只25 mL 烧杯分别作为滴定管和对照管。对照管加入底物缓冲液8 mL，15 mmol/L EDTA 1.1 mL，样本0.4 mL。测定管加入底物缓冲液8 mL，0.5 mmol/L CaCl20.2 mL， 样本0.4 mL。37 ℃水浴后， 对照管加入0.5 mmol/LCaCl2 0.2 mL，测定管再加 入15 mmol/L EDTA 1.1 mL。混匀后用高灵敏度pH 计分别测量两管的pH 值，用 微量吸枪吸取新标定的稀盐酸(0.004 mol/L)将对照管的pH 滴定至测定管的pH 值，以所消耗的盐酸测定观众酶的活力。1 个PLA2 活性单位规定为在37℃下， 每分钟每毫升样本反应消耗1 nmol 盐酸[1 U=1 nmol/(mLmin)]。
PLA2(U)=NV1062.5/t;N、V 分别为所消耗盐酸的体积(mL) 和浓度(mol/L)，t 为 反应时间(min)。
2)采用免疫组化法检测移植髓核髓核IL-6 和TNF- 表达的影响：
术后28 d 分别取6 个移植髓核标本，10%甲醛溶液固定。将玻片放在玻片架上置于烘箱(温 度60 ℃)中烘烤60 min。PBS 浸泡，然后加上100 L 的血清37 ℃孵育30 min。擦 去过多的血清，加入一抗室温孵育过夜。滴加HRP 标记的二抗，37 ℃孵育30 min。
PBS(0.01 mol/L)清洗5 min，共3 次。DAB显色(镜检出现黄色即可终止实验，用 去离子水终止显色实验。将终止显色的玻片用自来水冲洗， 用苏木素复染45 s。
用自来水冲洗复染过的玻片，然后用0.5%～1%的盐酸酒精分化2 s，除去非特异 结合的苏木素(苏木素特异性结合细胞核)， 然后迅速放置流水里冲洗。用中性 树胶封片， 然后置于凉片架上放在通风橱内凝固。用光学显微镜观察各组免疫 组化染色切片， 将免疫组化染色切片置于相同强度光线下用高倍镜观察，随机 选取视野(每张切片选取5 个视野)，通过数码摄像机摄取图像，保存。利用图像 分析系统，设定测量参数后，计算各个标本每个视野中阳性细胞数，对图像进行 全屏分割并进行自动测量、记录。阳性细胞反应结果为相应部位呈棕黄色或棕褐色染色。在高倍镜下，同等光照强度下，每张切片利用随机拍摄的5 个视野相片， 先测出图片的有效测量面积，然后测该面积区域内阳性细胞个数。
1.7 统计学处理 应用SPSS19.0 统计软件处理。实验结果满足正态分布和方差齐性，以(xs) 表示，t 检验采用配对t 检验和两组独立样本t 检验， 多组间差异显著性检验用 单因素方差分析， 组间比较用SNK(q)检验， 各处理组与对照组比较用Dunnett t 检验。P 0.05 为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组大鼠髓核组织中PLA2 活性比较。造模成功经大鼠灌胃后第7 日， 各实验组PLA2 的活性达到最高峰，但中药组、西药组明显低于模型组(P 0.05 或 P 0.01)。在第7 日， 中药组对髓核组织中PLA2 活性的影响不如西药组明显， 差异无统计学意义(P 0.05)，说明在第7 日两组都可以对髓核组织中的PLA2 活性 起到抑制作用， 但中药组不如西药组明显。在第14、28 日，中、西药两组较模 型组都可以对髓核组织中的PLA2 活性起到抑制作用(P 0.05)，模型组髓核组织中 的PLA2 活性值仍处在较高的水平。在各个时间段中、西药物两组在治疗效果无 明显差异，说明枳壳甘草汤同样能起到抑制炎症因子， 降低髓核组织中PLA2 活 性的作用。
2.2 各组大鼠腰椎间盘突出模型髓核中IL -6 和TNF- 表达比较见表2，图1， 图2。在造模28 d 后，各组移植髓核组织内阳性细胞反应结果为相应部位呈棕黄 色或棕褐色染色。其中模型组IL-6 和TNF- 表达高于西药组和中药组(P 0.05 或P 0.01)，中、西药组比较差异无统计学意义(P 0.05)，表明中、西药物在下调髓核 中IL-6 和TNF- 表达上没有区别。
3 讨论 本课题所选用的枳壳甘草汤系全国名老中医、全国师承制导师之一的龚正 丰教授在总结吴门医派葛氏伤科基础上加之其临证经验总结而成。龚正丰教授认 为络脉是气血运行的通道， 络脉阻滞不通则引起各种疼痛，即不通则痛。龚老 在自己多年骨伤科临诊的基础上，针对LDH气滞不畅、瘀血内停、津凝水聚的病 理机制，依据络以通为用，宜疏不宜堵的原则，提出以理气化瘀利水通络法治疗 LDH， 拟方枳壳甘草汤，方药组成为枳壳、甘草、当归、丹参、三棱、莪术、 黑白丑，临床随症加减。自从PLA2 被发现在突出髓核中存在后， 引起了临床的关注， 对其的研 究也在不断的加深。彭宝淦等研究发现正常机体内的PLA2 受到两种因素的影响， 一种是内源性抑制物， 另一种是促进物PLA2 激活蛋白。当这两种影响因素失 衡后，机体启动PLA2 蛋白，这也是引起椎间盘组织发生退变的重要因素。因此 通过下调PLA2 的活性，可恢复人体内的这种平衡，从而延缓椎间盘的退变。有 学者为了证实PLA2 的致炎性。其他学者采用硬膜外移植髓核的方法观察大鼠的 疼痛行发现PLA2 在诱发神经根疼痛机理上起一定作用;
另一方面说明采用 PLA2 抑制剂能够减轻LDH患者的神经根疼痛LA2 其作为局部炎症组织的启动 物质，在炎症形成过程重起着关键作用，因此抑制这种酶活性可减少PG、LT 和 血小板激活因子(PAF)，减轻TNF 的细胞毒作用， 可起到减缓腰椎间盘的退变， 对缓解腰腿痛等临床症状具有重要意义。
本实验研究结果显示， 在大鼠造模后7 d 各组的PLA2 活性值达到最高， 经枳壳甘草汤干预7 d 后PLA2 活性值明显下降，但不如西药组明显。但在14、 28 d 后枳壳甘草汤组髓核组织中PLA2 活性值与西药组差异不明显，中、西药 物在降低PLA2 活性值方面无差异，说明枳壳甘草汤具有降低突出髓核组织中 PLA2活性值的作用， 起到和抗炎镇痛类西药同样的效果。其作用机制可能与枳 壳甘草汤中药有效成分具有的抗炎、降低血液黏稠度、抑制血小板聚集和凝血功 能、改善微循环等作用有关。从本实验的研究结果发现，枳壳甘草汤可抑制髓核 组织中PLA2 的活性， 为临床治疗LDH 提供了新的思路。
Gronblad 等研究发现TNF- 可增加退变椎间盘组织细胞中PG 等炎性介 质的含量， 诱发椎间盘继发性的病理变化。TNF- 是具有强致痛的炎症介质， 可侵入神经根组织中，从而产生神经根疼痛。Liu 等运用TNF- 直接作用于离体 的退变椎间盘细胞，检测后显示TNF- 可提高MMPs 的表达，两者之间在一定程 度存在着时效关系。IL-6 则是具有多功能的炎症细胞因子。现在的研究表明，IL-6 具有促进炎症和抗炎的双重特性。IL-6 能够增加炎症介质的聚集、促进炎症介 质的合成分泌， 并对MMPs 的表达起到一定的诱导作用。IL-6 还导致蛋白聚糖 Ⅱ型胶原的比例失调，使得髓核中的水分加速流失，最终导致椎间盘退变的加速。
王民等对正常的椎间盘组织及突出椎间盘组织进行体外培养，发现突出椎间盘组 织中IL-6 含量高于正常椎间盘组织， 采用免疫组化法显示，IL-6 阳性细胞在突 出椎间盘组织中表达最强，提示IL-6 可能参与了腰椎间盘退变的过程。
本实验研究发现， 枳壳甘草汤能明显抑制移植髓核内阳性细胞IL-6 和 TNF- 的表达， 从而减轻炎症介质的合成，下调MMPs 的表达，起到延缓椎间盘退变的作用。这可能与枳壳甘草汤中的中药成分作用有关，比如枳壳成分川陈 皮素具有抑制血栓、抑制基质金属蛋白酶表达及抗炎镇痛的作用;
当归提取物能 够提高小鼠对热刺激致痛的痛阈值，起到有抗炎镇痛作用;甘草提取成分中甘草 次酸具有明显的抗炎作用， 同时具有肾上腺皮质激素样作用，可起到解痉止痛 的作用。