谈不同构建方法对肾阳虚大鼠模型的影响
谈不同构建方法对肾阳虚大鼠模型的影响 肾阳虚大鼠模型是研究中医阴阳学说和补阳药物作用机制的重要手段，它 需要符合中医肾阳虚典型症状，如精神萎顿、体毛干枯不齐、反映迟钝等。历来 建模方法各式各样，然缺乏比较分析，不同建模方法对大鼠的病理生化产生不同 的影响，如腺嘌呤构建的肾阳虚模型同时也会影响生育，适合研究不育症。因此， 不同建模方法对于中药药效评价和机制研究也不同。探索简便有效的肾阳虚大鼠 建模方法，明确其病理生化变化，对药效学研究及机制探讨具有重要作用。本文 报道腺嘌呤和氢化可的松构建的肾阳虚大鼠模型肾脏睾丸及SU、Cr、SOD、MDA 的变化，供研究参考。1 材料和方法 1. 1 材料 1. 1. 1 实验动物SPF 级雄性SD 大鼠21 只，体重180 ～ 200 g，来源: 广 州中医药大学实验动物中心，许可证号SCXK( 粤) 2013 - 0020。
1. 1. 2 主要试剂及仪器未提纯的腺嘌呤Ameresco( 生产批号: 20130325) ， 广州华奇盛生物科技有限公司，氢化可的松( 100mg /20mL，生产批号: 1106021) ， 天津金耀氨基酸有限公司。总超氧化物歧化酶( SOD) 测定试剂盒( WST - 1 法， 货号: A001 - 1，生产批号:201412) 、丙二醛( MDA) 测定试剂盒( TBA 法，货 号:A003 - 1，生产批号: 201412) 、Rat AdrenocorticotropicHormone ( ACTH) Elisa 测定试剂盒( 生产批号:201412) ，南京建成生物工程研究所。BX - 51 型病理图 像采集系统( 日本奥林巴斯公司) 。Labsystems Finnpipette100L 单道移液器;
Thermo 50 L 8 道移液器;
HH - 4 数显恒温水浴锅( 国华电器有限公司) ;
华东电 子DG5033A 酶标仪( 南京华东电子集团医疗装备有限责任公司) 。
1. 2 实验方法 1. 2. 1 分组与造模按随机数字表法把动物分为3组: 空白组( 7 只) 大鼠 按2 mL /只皮下注射生理盐水，连续10 d。腺嘌呤组大鼠( 7 只) 皮下注射未提纯 腺嘌呤，剂量0. 2 g / ( kgd) ，连续10 d。氢化可的松组大鼠( 7 只) 大腿内侧肌肉 丰厚处注射氢化可的松25mg / ( kgd) ，连续13 d。
1. 2. 2 一般情况观测大鼠的活动度、对外界反应的灵敏度、皮毛光泽、饮食、饮水、死亡情况。
1. 2. 3 大鼠自主活动度实验结束后，将大鼠投入干净饲养盒中，适应3 min 后，计算各鼠2 min 内的自由活动时间。
1. 2. 4 大鼠游泳时间自主活动度测量结束后，将大鼠放入盛满常温水的水 箱中，测量大鼠放入到开始下沉的时间为游泳时间。
1. 2. 5 标本的采集与制备经过12 h 后，摘眼球取血，血液常温放置1 h 后 4 ℃离心机3000 r /min 10 min离心，取血清。大鼠颈椎脱臼处死，取肾脏睾丸观 察并称重，把肾脏睾丸用10%甲醛溶液固定并放至- 20 ℃冰箱保存，常规石蜡包 埋，切片，HE 染色，光学显微镜下进行组织病理学检查。
1. 2. 6 指标测定血清尿素采用脲酶- 波氏比色法，血清肌酐采用苦味酸速 率法，均通过测定吸光光度值计算。血清SOD 水平采用TBA 法，通过测定OD 值 计算;
血清MDA 水平采用WST - 1 法，通过测定吸光光度值计算。
1. 3 统计学方法 数据用均数 标准差( 珋x s) 表示，符合正态分布及方差齐性用方差分析， 组间比较采用SNK - q 检验，方差不齐采用Dunnett T3 检验，P 0. 05 为有显著 性差异。
2 结果 2. 1 各组大鼠表现空白组大鼠无疲倦，活动正常，饮食量逐渐增加，体重 增加。腺嘌呤组大鼠疲倦，饮食量减少，体重减轻，体毛稀疏无光泽，有集群现 象。氢化可的松组大鼠饮食量减少，体重减轻，注射部位出现大片脱毛，无光泽， 甚至脱皮后结痂，有集群现象。
2. 2 各组大鼠肾脏睾丸HE 染色结果空白组大鼠肾脏睾丸表面色泽鲜红， 肾皮质与肾髓质结构清晰、分界清晰，生精小管排列紧密，间质细胞丰富，生精 小管内的生精细胞排列规则，层次清晰，精子数目多。腺嘌呤组肾脏表面色泽鲜 红，体积略增大，肾皮质略微固缩，肾小管管腔变窄，肾间质水肿、充血伴明显 的炎性细胞浸润;
睾丸生精小管萎缩变性，排列疏松，间质退化、细胞减少，各 级生精细胞排列松散，不规则，精子数量较少。氢化可的松组肾脏表面色泽鲜红， 肾皮质固缩不明显，与肾髓质分界清晰，肾间质有炎性细胞浸润;
睾丸生精小管略萎缩，排列疏松，各级生精细胞排列松散，不规则。
2. 3 大鼠脏器指数、自主活动度和游泳时间与空白组比较，腺嘌呤、氢化 可的松组大鼠肾脏和睾丸指数均增大( P 0. 05) ，自主活动度游泳时间均较低( P 0. 05) ;
且与比腺嘌呤组比较，氢化可的松组睾丸指数高( P 0. 05) ，自主活动度低 ( P 0. 05) 。
2. 4 大鼠血清尿素、肌酐水平和SOD、MDA 活力与空白组比较，腺嘌呤 组大鼠血清肌酐、SOD 和MDA 活力均增高( P 0. 05) ，氢化可的松组大鼠血清 肌酐、SOD 活力均降低( P 0. 05) ，MDA 活力增高( P 0. 05) ;
且氢化可的松组 血清肌酐和SOD 活力均比腺嘌呤组低( P 0. 05) 。
3 讨论 阳虚动物建模需要与临床复杂的证候相一致，构建符合临床实际的动物模 型对于方药研究有着重要作用。肾阳虚动物模型作为研究补阳药物或方剂的重要 手段，目前诊断标准主要采用《中医虚证辨证参考标准》，依据动物的外观、行 为等来评判其吻合程度，以确定模型成功与否。本研究发现腺嘌呤或氢化可的松 建模，动物均表现出疲倦，饮食量少，体重减轻，体毛稀疏无光泽，反应迟钝， 自主活动度降低，游泳时间短等症状，中医认为此乃阳气不振，阴寒内盛，神失 所养。阳气不振，温煦推动功能减弱，血脉运行不畅，经络失养，发于皮毛则体 毛稀疏无光泽;
影响运化之力，则饮食量少，体重减轻;
无力升腾，则神失所养， 疲倦萎靡。《黄帝内经》提到阳主动，阴主静，因此，自主活动度减少，游泳时 间减少乃机体阳虚状态。故两种建模方法从临床表现和行为上，均符合肾阳虚证。
血清肌酐( Cr) 由外源性和内源性组成，当肾实质损害，肾小球滤过率( GFR) 降 低到正常的1 /3 时，Cr就会明显上升;
尿素是蛋白质代谢的终末产物之一，在肝 中经鸟氨酸循环生成，进入血液循环由肾脏排泄，当肾实质受到损害时，GFR 降 低，血清尿素( SU) 浓度升高。本研究发现，腺嘌呤组大鼠肾脏出现肾皮质略微 固缩，肾小管管腔变窄，肾间质水肿、充血伴明显的炎性细胞浸润等病理变化， 同时与空白组比较，Cr 水平明显升高，SU 有升高趋势，说明腺嘌呤建模会影 响肾小球滤过功能。另外，有研究认为，氢化可的松可促进机体能量的过度消耗， 从而出现一系列耗竭现象，即拱背蜷曲，集群，游泳时间缩短等。由于本研究中 氢化可的松组大鼠饮食量减少，机体能量又过度消耗，导致肌酐生成的外源和内 源途径均减少，可能是其Cr 降低的原因。具体原因有待进一步研究。SOD 是细 胞抗氧化酶促防御系统，当体内自由基生成增多时，SOD 可清除超氧阴离子， 从而保护细胞免受伤害，故SOD 反映了细胞的自我保护能力。MDA 是自由基与生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的代谢产物，当细胞受到氧自由基攻 击从而引发链式脂质过氧化反应，就会产生大量MDA 损伤细胞膜，进而使细胞 死亡。有研究表明，SOD、MDA 参与肾损伤的调节。本研究发现，与空白组比 较，腺嘌呤组SOD 和MDA 活力均增高，考虑大鼠自身能量未被消耗，抵抗能 力较强，但其引起肾小球滤过率降低等病理改变，使自由基产生增多，细胞受到 氧自由基攻击，故两者均增高。而氢化可的松组SOD 活力降低和MDA 活力增 高，与以往研究相同，可能是由于氢化可的松一方面过度消耗机体能量，抵抗外 来损害能力减弱，另一方面它又对肾脏睾丸有一定损害作用，自由基产生增多， 细胞受到氧自由基攻击反应，从而使SOD 降低、MDA 升高。具体原因有待进 一步研究。综上，腺嘌呤与氢化可的松构建肾阳虚模型在虚证表现和肾脏睾丸病 变上相似，但作用方式不同，腺嘌呤可能是通过损害肾滤过水平、睾丸生理功能 等引起血清肌酐、SOD 和MDA 活力升高，氢化可的松则可能是通过耗散机体 能量，减弱机体抵抗能力，影响血清肌酐生成、降低SOD 活力和增高MDA 活 力，具体原因有待进一步探究。