木犀草素对粪肠球菌毒力因子作用机制的研究
木犀草素对粪肠球菌毒力因子作用机制的研究 牙髓病和根尖周病常由细菌感染引发，目前临 床上常采用根管治疗 术对其进行治疗。我国根管治 疗的技术虽然已经很成熟了，但临床上结合各种 因素仍存在一定的失败率。近年来很多学者认为根管内微生物的感染是造成根管 治疗失败的主要原 因[1—2]。有报道表明，在根管治疗失败的病例中，粪 肠球 菌的检出率较高，说明粪肠球菌是较常见的细 菌[3]。粪肠球菌常常继发于根管 内而感染，是主要 致病菌，它的生存能力极强。粪肠球菌的生存力较 顽固，其 生物被膜的存活力和致病性更加顽强，传 统的根管治疗术对形成生物被膜的根 管的治愈率不 高。因此对于微生物的感染造成治疗失败的研究受 到广大研究者 的关注。加之现在临床上使用的消毒 药物对感染粪肠球菌的根管的消毒效果不 佳，甚至 有些消毒药物还具有一定的毒副作用，导致粪肠球 菌产生耐药性，所 以越来越多的研究者转向来研究 毒副作用小并且不容易形成抗药性的中药。本 研究 的意义在于更进一步的了解木犀草素对生物被膜状 态下的粪肠球菌的抑 制效果并探讨其对粪肠球菌毒 力因子gelE、esp、ebpA的影响的机制。1 材料与方法 1.1主要材料和仪器粪肠球菌标准株ATCC (广 东环凯生物科技有限公司）， 木犀草素标准品（上海 金穗生物科技有限公司，产品批号20150301， HPLC98%)， 脑心浸液琼脂培养基、脑心浸液肉 汤（杭州天和微生物试剂有限公司），噻唑 兰、 MTT (上海金穗生物科技有限公司），二甲基亚砜 (天津致远化工有限公司）， 引物（上海生工生物工 程有限公司），Biometra PCR 仪（BIOME-TRA， 德国）， SMARTSPECTMPLUS超微量分光光度计 (美国），琼脂糖（西班牙），PBS缓 冲液（博士德 生物）。
1.2 方法 1.2 1菌悬液的制备首先取粪肠球菌标准株接种 于装有BHI液体培养基的 试管中37 °C摇床厌氧复 苏24 h。将复苏后的粪肠球菌划线接种于BHI琼脂 培养 基中，放置在37 C恒温培养箱里厌氧培养 24 h。挑取24 h后固体培养基上的单个 菌落放置于 装有BHI液体培养基的试管中，37 C摇床里培养 24 h;最后利用麦氏 比浊法配制菌悬液并使其浓度 达到 0. 5 McFarland (1X108 个细胞/mL)。1. 2 2药液的制备取木犀草素标准品用二甲基亚 砜溶解使其浓度达 到16 mg/mL，过滤后，利用对倍 稀释法将木犀草素稀释成8、4、2、1和0. 5 mg/mL 的浓度，备用。
1. 2 3木犀草素对粪肠球菌生物被膜的抑菌性的研 究用灭菌后96孔 板，向每孔中放50 pL的粪肠球 菌菌悬液和150 pL的BHI液体培养基，封口膜密 封，37 C条件下厌氧培养24 h (激光共聚焦）观 察，待成功建立粪肠球菌生物被 膜模型，严格贴壁 去除原液体，同时随机分7组包括5个实验组、 1个阴性对照 组、1个空白对照组；
分别向实验组中 加入100 PL的浓度为8、4、2、1和0. 5 mg/mL 的 木犀草素药液，阴性对照组含有液体培养基和菌悬 液，空白对照组只含有 BHI液体培养基；
将96孔 板放于培养箱中37 C条件下厌氧培养12 h。12 h 后无 菌PBS冲洗2〜3次去除药液。每孔中加入20 PL MTT药液（浓度为5 mg/mL)，37 C 避光培 养4h。每孔放100 PL的二甲基亚砜溶液，摇床震荡 15 min；
待结晶体消 失后，全自动酶标仪分别检测490 nm的吸光度（A值）。如下公式计算：抑菌率 = (阴性对照组A值一实验组A值）/ (阴性对照组A值一空白对照组A值）X100%。
1. 2 4 CLSM观察不同浓度木犀草素对粪肠球菌 生物被膜的影响将 经高压灭菌后的20 mm X 20 mm的盖玻片放在6孔板中，分别在盖玻片表面 滴加 300 PL的粪肠球菌菌悬液，再沿6孔板的侧壁 向其中小心加入3 mL的BHI液体培 养基，封口膜 封口，37 C恒温培养箱厌氧条件下培养24 h。经共 聚焦检测确定 生物被膜模型建立成功后，去除原培 养液同时将其随机分为6组（5个实验组和1 个阴 性对照组），分别向5个实验组中加入浓度为8、4、 5、1、0. 5 mg/mL的 木犀草素药液，阴性对照组中 不加药液，封口膜封口，继续厌氧培养12 h。12 h 后去除液体。PBS小心冲洗2〜3次去除表面浮游的 细菌；
然后滴加2.5%的戊二 醛固定10 min，再次 用PBS缓冲液小心冲洗2〜3次后，分别在生物被 膜表面滴 加150 pL染色剂（AO、EB等份混合后0 = 20稀释成工作液），暗室室温孵育15 min 后，用 CLSM观察生物被膜中死菌与活菌的密度及其比例 (镜下活菌呈绿色，死 菌呈红色）。1. 2 5木犀草素对粪肠球菌的毒力因子影响的研究0. 2 5. 1分组处理和 PCR扩增选取适应浓度的木 犀草素（8、4、2和0 mg/mL)，分别加入到配制好的 粪肠球菌菌悬液中。置于37 C厌氧条件下培养24h 后，分别取1 mL样本按Total RNA提取试剂盒 (RNAISO TM Plus)要求提取其总RNA；
并用RNA PCR KIT (AMV) VER 3 0试剂盒反转录合成cDNA。
同时用由上海生工生物合成设计的3 对引物（见表1)， 按PCR反应试剂盒说明，通过PCR仪，对粪肠球菌毒 力因子 gelE、ebpA、esp进行PCR扩增。扩增后的 PCR产物，置一20 C冷冻冰箱，备用。
0. 2 5. 2琼脂糖凝胶电泳及其分析取0. 6g的琼脂糖粉末与40 mL1XTAE电泳缓冲 液混合,加热 至全部溶解后,再向其中加入0. 4 PL的EB,混合 后，沿侧壁缓慢使液 体流入胶板中，冷却制成凝胶。
将样本（8 pL PCR扩增产物+ 2 pL的6XLoading buffer混合液)滴加入凝胶小孔中，于120 V, 30 min 条 件 下 进 行 电 泳 。
电 泳 30 min 后 ， 取 下 凝 胶 置于UVI成像仪上。观察结果并进行拍照，最后 利 用软件进行分析。
1.3统计学分析所有数据均采用SPSS 17. 0统计 软件进行整理和统计。
计量资料采用均数士标准差 (王±0表示。两组间计量资料的比较采用z检验。
P0. 05为差异有统计学意义。
2 结果 2 1不同浓度木犀草素对粪肠球菌生物被膜的抑制 率不同浓度的木犀草 素作用于粪肠球菌生物被膜 24 h后，运用MTT法测各组的A值并计算木犀草 素 的抑囷率；
最后的结果显示：在0. 5〜8 mg/mL 的浓度区间随着药物浓度的增加 其抑菌能力也增强。
木犀草素的浓度为0. 5 mg/mL时其抑菌率为 40. 02%。当达 到8 mg/mL时抑菌率为90. 55%。
并且各组的抑菌率分别与阴性对照组相比差异 均有 统计学意义（P〈0. 05)(见表2)。
表2不同浓度木犀草素对粪肠球菌生物被膜的抑制率 随着药物浓度 依次增加各条带的亮度逐渐变暗。（2) 当药物浓度达到8 mg/mL时各毒力因子的 条带基本 消失。（3)各组别与阴性对照组两两比较，差异有 统计学意义（P〈0. 05)，见表3。说明木犀草素不 同程度的抑制了粪肠球菌毒力因子gelE、esp、 ebpA的表达；
并且随着药物浓度的增加其抑制效果 逐渐增加。
2 2木犀草素对粪肠球菌生物被膜的影响不同浓 度的木犀草素作用 于粪肠球菌生物被膜， 通 过 AO 和EB染色后，CLSM镜下观察活菌和死菌的 密度 及其比例。在0. 5〜8 mg/mL浓度区间内CLSM观 察到死菌的数量逐渐增加。
说明木犀草素对粪肠球 菌生物被膜的生长活性有抑制作用（见图1)。
2 3不同浓度的木犀草素对粪肠球菌的毒力因子 gelE、esp、ebpA基因 表达水平的影响最后的 PCR扩增产物进行电泳后的结果显示：（1)阴性对 照 组 时 毒 力 因 子 gelE、 esp、 ebpA 的 电 泳 条 带 最 亮，药物浓度为2mg/mL 时其条带的亮度次之，但3讨论木犀草素是中药夏枯草(LuteoUn)的主要有 效成 分之一。木犀草素属于黄酮类化合物，具有抗 菌、抗炎、保护心血管、解痉、 祛痰、抑制酶活性、 免疫调节、抗氧化、抗辐射、利尿、利胆、抗肿瘤等等多 种特性[4]。有研究报道夏枯草对肠道致病菌 和条件致病菌具有较强的抑制作用， 但对于木犀草 素对粪肠球菌的作用尚没有研究，故本实验选取夏枯 草中的木犀 草素成分作为研究对象，探讨其对粪肠球 菌的作用 。
实验最后的结果显示：
在 0 5〜8 mg/mL，木犀草素对粪肠球菌生物被膜能起到抑制效果，并且 随着药物 浓度的逐渐增加其抑菌效果也逐渐明显，当 浓度达8 mg/mL时，其抑菌效果最 明显。
3.讨论 粪肠球菌在根管再治疗患者的根管中检出率高 且数量多，极易形成生物 被膜，产生抗药性，使治 疗难度加大[6]。有研究报道：粪肠球菌极易在根管 内 形成生物被膜可能与其毒力因子明胶酶（gelE)、 表面蛋白（Esp)和菌毛操纵子 （ebpA)等有关系。
gelE：是细胞外锌金属蛋白酶的一种，可以酶解宿 主细胞 壁和细胞间质的胶原蛋白[7]，它的长度大概 为1 530个碱基，位于粪肠球菌染色 体上。粪肠球 菌调节因子基因fe•和3个启动子位于其上游，能 够影响明胶酶的 表达水平。下游主要与其一起参与 宿主的组织损伤，是丝氨酸蛋白基因SprE。
明胶酶 对组织的形成和重塑是通过胞外的降解作用来调节 的。经研究发现去除 giE基因后，粪肠球菌形成生 物被膜的能力下降[8]。ebpA: ebp基因座主要影响 菌毛形成，而生物被膜形成的必要条件就是菌毛的 形成。bpA是粪肠球菌菌毛操纵子，常常发现于粪 肠球菌分离株中，影响着生物被膜和菌毛的形成[]。
有 研究发现：与野生株比较，bpA表达水平和菌毛 蛋白生成量减少，生物被膜形 成量也会跟着下 降[1°]。
Esp：由1 873个氨基酸组成的与细胞壁相 关的蛋白，在粪肠球菌中它的 表面分子质量最大， 由5 622个碱基对构成e#基因。e#基因的菌株可 诱发多重 感染，esp基因普遍具有形成生物被膜的 能力，可使细菌的感染更加持久，呈慢 性长期的趋 势，因此提高了感染能力[11]为了说明木犀草素对粪肠球菌的抑菌 作用是否 通过其相关毒力因子而完成。本实验选择与粪肠球 菌生物被膜相关联 的3种毒力因子gelE、esp、 ebpA为研究对象，观察不同浓度作用后的变化。
结果显示:（1)木犀草素的浓度在 0. 5 〜8 mg/mL 时， 对粪肠球菌的3种 毒力因子gelE、esp、ebpA的 mRNA的表达均有不同程度的干扰或抑制作用。即 随着浓度的增加，其对3种毒力因子表达的抑制作 用越来越强。当浓度达到8 mg/mL时可完全抑制 gelE、 esp、 ebpA 3种毒力因子mRNA的转录表达 水平。
（2)实验结果提示：木犀草素对粪肠球菌生 物被膜及相关毒力因子均有明显的 抑制作用。这一 研究发现显示木犀草素的应用前景广阔。（3)大量 文献显示木 犀草素具有抗炎、抗金黄色葡萄球菌等 作用，但是目前尚没有研究发现木犀草 素对粪肠球 菌及其毒力因子的抑制作用，而本实验对这一空缺 进行了实验研究， 对木犀草素的临床应用提供理论 基础。