微生物检测方式对比
微生物检测方式对比 微生物主要包括原核微生物、真核微生物、病毒等三大 类，由于多数微生物的个体较小，肉眼无法观察，对其计数 一般比较困难。在目前的微生物实验教学中，对微生物计数 的方法主要有三大类:总细胞计数法、活细胞计数法和微生 物生长量测定法。并不是每一种方法都是通用的，不同的微 生物种类需要不同的计数方法，目前多用以下8种方法进行 计数: 1总细胞计数法 1.1血细胞计数板计数法 血细胞计数板是一块特制的载玻片，其上划有计数室， 通过对计数室中的微生物数量的读取，计算原溶液中的微生 物数量。此方法由于计数板较厚，且计数室的高度是0.1~， 不能采用油镜进行观察，故只能对体积较大的真核微生物进 行测定，如酵母菌、霉菌抱子等，只能测得所有细胞的总数， 不能区别死细胞和活细胞，尤其是对运动能力强的活细胞难 以计数。目前已经提出一些方法，如结合特定的美蓝染色技 术，区别酵母菌死活细胞;将运动的细胞加人甲醛溶液中， 破坏其运动以便计数等。1.2细菌计数板计数法 细菌计数板是在血细胞计数板的基础上改进而来，主要 是降低计数板的厚度，同时将计数室的高度从0.1~降低到 0.02~，以用油镜对较小的原核微生物进行计数。1.3膜过滤计数法 利用计数板对高浓度的菌液测定比较准确，但当样品中 细菌的数量很低时，如湖水、海水或饮用水等，用膜过滤计 数法更精确些，可以将一定体积样品溶液加结晶紫染色，再 用0.22卜m的聚偏二氟乙烯膜负压过滤，再用无菌水冲洗至 无色后，将过滤的膜进行抽干，将膜放到载玻片上，滴加甘 油，盖上盖玻片，即可在显微镜下计数。一般随机抽取20个 视野进行计数，最后算平均数，计算整个滤膜上的菌的数量， 得到原菌液中的微生物数量。此测定方法一般只能用于样品 中细菌数量很低的情况，多数时候细菌个体由于粘附成团而 影响结果。所以，过滤前的细胞分散处理很重要，例如将细 菌悬液经过酸碱或超声波处理，将聚团的细胞打散，可以增 加此方法的准确性。
2活细胞计数法 2.1平板菌落计数法 平板菌落计数法只能用于测定活细胞的数量，但是操作 过程相对计数板而言复杂一些，而且测得的细菌数量往往小 于实际值。主要原因是在计算细菌浓度时，往往每个菌落并 不一定是由一个单细胞生长繁殖而来，有可能是2个或多个， 致使结果比实际菌液样品中的细菌数量低，这也就是为什么 现在都用菌落形成单位数(c何mL)来取代过去的绝对细菌数 量。为了使菌落数更接近实际菌液中细菌的数量值，目前多 数办法是:尽量扩大稀释倍数，涂布平板时少取稀释菌液，使平板中的菌落数减少，避免由于菌液中细菌数过多造成多 个细菌形成一个菌落。例如，将系列梯度稀释至10一8或更 低(稀释倍数取决于原菌液)。
2.2比浊法 微生物细胞在一定浓度范围内，与浊度成正比，即与光 密度成正比，菌越多，光密度越大。故可通过分光光度计测 定吸光值，通常测定600nm下的吸光值OD石(X)，通过与标准 曲线对比，求出样品中菌液浓度，计算出细胞的数量。实验 测定时容易出现误差，必须控制菌浓度在与光密度成正比的 线性范围内，否则不准确。
2.3霉菌计数法 对于霉菌的计数一般比较困难，由于霉菌生长快、菌丝 叠加导致无法准确计数。国标霉菌计数法的原理是:将待测 菌液进行10倍梯度系列稀释，利用高盐察氏培养基(CAO)与 待测菌液混匀后倒平板，25℃一28(土1)℃下培养3d后开始 计数，选择菌落数在10一150之间的平板进行计数，取同稀 释度的两个平板的菌落平均数乘以稀释倍数，即为每g(或 mL)检样中所含霉菌数。
3微生物生长量测定法 3.1凯氏定氮计数法 蛋白质是微生物细胞的主要成分，含量较稳定，可以通 过测定样品中含量稳定的蛋白质的量计算细菌的数量，将细 胞洗涤收集，用凯氏定氮法测全氮，蛋白质含氮量为16%，细菌中蛋白质含量因种类的不同而有差别，平均值为65%， 根据每一种微生物细胞内的蛋白质总含量可以计算出待侧 样品中细胞的总质量，最后根据单个细胞的质量计算出样品 的细胞数量。总含氮量与蛋白质之间的关系为:蛋白质总量= 含氮量/16%，那么，微生物细胞总质量二蛋白质总量/65%， 微生物细胞总数=细胞总质量/单个细胞质量。每一种微生物 细胞的蛋白质含量不同，且不同时期的细胞蛋白质含量、单 个细胞的质量都有差别，所以用此方法测定的结果误差较大， 只能作为参考。
3.2DNA含量测定法 相比凯氏定氮计数法较大误差，DNA含量测定法相对较 准确。每个微生物细胞的DNA含量非常恒定，平均为8.4xl0-5， 将一定体积的细菌悬液离心，从细菌细胞中提取DNA，得其 重量，则可计算出这一定体积的细菌悬液所含的细菌总数。
4总结 本文对常用的8种微生物数量测定方法进行总结与比较， 血细胞计数板和细菌计数板常用于测定单细胞或抱子，相对 比较准确;膜过滤用于测定细胞浓度很低的样品，平板菌落 计数对多数微生物的测定都适用，但是相对其他计数法要复 杂;比浊法相对准确，但需要作标准曲线;对于丝状微生物的 数量测定，国际上有明确的标准;而凯氏定氮法和DNA含量测 定法都是通过对微生物细胞内含量相对稳定的物质进行定 量测定，再算出细胞的数量，操作相对复杂。