讨论牛黄清心丸中黄曲霉毒素的检测
讨论牛黄清心丸中黄曲霉毒素的检测 1960 年英国科学家从花生粉中发现的一种致癌物质黄曲霉毒素 ( aflatoxin) ，它是由黄曲霉和寄生曲霉生长后期产生的一组化学结构类似的次生 代谢产物，具有强烈的肝脏毒性，主要污染油类食物，如花生、玉米和大米等， 早期在食物中检测。常见的黄曲霉毒素有B1、B2、G1和G2 4 种，其中黄曲霉毒 素B1( AFB1) 被世界卫生组织的癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物质。随着人们对 药品安全的日益关注，我国针对中药材在储存过程中，极易发生霉变的现象，于 中国药典2010 年版一部中对陈皮、酸枣仁、桃仁、僵蚕和胖大海等药材中的黄 曲霉毒素限量进行了规定，其中AFB1含量不得超过5 gkg - 1，B1、B2、G1和G2 总量不得超过10 gkg - 1。在2014 年国家药品评价性抽验中，牛黄清心丸( 局方) 中的六神曲( 炒) 为发酵产物，容易产生黄曲霉毒素。因此对38 批次牛黄清心 丸( 局方)样品的黄曲霉毒素进行限量检查。牛黄清心丸( 局方) 收录在中国药典 2010 年版一部及第一增补本，剂型为蜜丸和水丸2 种，处方是由牛黄、当归、 川芎、甘草、山药、黄芩、炒苦杏仁、大豆黄卷、大枣、炒白术、茯苓、桔梗、 防风、柴胡、阿胶、干姜、白芍、人参、六神曲( 炒) 、肉桂、麦冬、白蔹、蒲 黄( 炒) 、人工麝香、冰片、水牛角浓缩粉、羚羊角、朱砂和雄黄共29 味药材 组成，成分十分复杂。针对抽验批次较多，检测期限较短的特点，实验采用胶体 金免疫层析技术( immune colloidal goldtechnique，GICA) ，快速测定牛黄清心丸 ( 局方) 中黄曲霉毒素总量和AFB1的含量。GICA 是20 世纪80 年代发展起来的 一种将胶体金免疫技术和色谱层析技术相结合的固相膜免疫分析方法。以AFB1为例，其原理是使样品中的AFB1首先与胶体金颗粒表面的抗 AFB1单克隆抗体反应，如果样品中AFB1的含量超过限量值，胶体金的抗体位点 将不再有剩余，当胶体金颗粒层析经过检测线时，胶体金颗粒将不会停留在该线 的所在位置，继续上行时与质控线上喷涂的羊抗鼠IgG 反应，呈现出胶体金的红 色条带。如果样品中不含AFB1或AFB1含量低于限值，胶体金表面的抗体将与检 测线上的化合物反应呈现出红色条带，质控线也呈现红色条带。GICA 快速检测 黄曲霉毒素已在食品和中药材中广泛应用。该法使用简单方便，非常适合现场快 速检测黄曲霉毒素的残留量。本实验选用70% 甲醇溶液提取样品中的黄曲霉毒 素，采用GICA 法进行检测，通过图像分析定量检测样品中黄曲霉毒素的含量。
为了防止复杂基质的干扰，建议对GICA 法检出阳性结果的样品，再经过免疫亲 和柱- 高效液相色谱法( IAC - HPLC 法)进行分析确证。
1 材料与方法1. 1 仪器 Waters e2695 分析型高效液相色谱仪，包括Waters 2489 DAD 检测器( 美 国Waters 公司) ;
光化学衍生器( 美国AURA 公司，反应线圈15 m，灯管254 nm) 。Cloversil C18反相色谱柱( 4. 6 mm 150mm，5 IAC - SEP 黄曲霉毒素总 量免疫亲和柱;
iCheck 食品安全定量快检仪;
iCheck 总黄曲霉毒素定量快 检试剂盒( 产品号: CS101 - J;批号: AF08200801) : iCheck 黄曲霉毒素快检卡 ( 25 套) ，黄曲霉稀释缓冲液( 5 mL) 和黄曲霉快检二维码;
iCheck AFB1定量 快检试剂盒( 产品号:CS103 - J;
批号: AF08200801) : iCheck AFB1定量快检卡 ( 25 套) ，均购自北京中检维康技术有限公司。
1. 2 试剂 甲醇、乙腈( 美国Fisher 公司，色谱纯) ;
黄曲霉毒素混合标准品( 北京中 检维康技术有限公司) 。样品处理及溶液配制中使用的超纯水由Mini - Q 超纯水 处理系统制备( 美国Millipore 公司) 。实验中抽取测试样品的信息。
1. 3 溶液配制 1. 3. 1 混合对照溶液精密吸取黄曲霉毒素混合 标准品( 黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2标示质量浓度分别为1. 0、0. 3、1. 0 和0. 3 gmL - 1 ) 100 L 至10mL 量瓶中，用流动相定容至刻度，得到含黄曲霉毒 素B1和G1为10 ngmL - 1，黄曲霉毒素B2和G2为3 ngmL - 1的溶液，即得。
1. 3. 2 磷酸盐缓冲溶液称取氯化钠8. 0 g，磷酸 氢二钠1. 44 g，磷酸二氢钾0. 24 g，氯化钾0. 2 g，用纯水990 mL 溶解， 然后用浓盐酸调节pH 至7. 0，再纯水稀释至1 000 mL，即得。
1. 3. 3 吐温/磷酸盐缓冲溶液将吐温- 201. 0 mL加入到1. 3. 2项下配制的磷 酸盐缓冲溶液中，混匀制成0. 1%的吐温/磷酸盐缓冲溶液。
1. 3. 4 供试品溶液水丸用研钵粉碎，蜜丸剪碎成小块，称取粉碎或小块样 品5. 0 g 于50 mL 离心管，待用。在上述称有样品的50 mL 离心管中加入70%甲 醇溶液25. 0 mL，剧烈振荡3 min 至完全溶解，用定性滤纸过滤，即得GICA 法 用供试品溶液。在上述称有样品的50 mL 离心管中加入氯化钠1. 0 g，加入70%甲醇溶液25. 0 mL，高速搅拌2 min，量取上清液10 mL 置于20 mL 量瓶中，用 水稀释至刻度，用0. 45 m 滤膜过滤，即得IAC -HPLC 法用供试品溶液。
1. 4 检测方法 1. 4. 1 GICA 法从iCheck 总黄曲霉毒素定量快检试剂盒或iCheck AFB1定量快检试剂盒中取出 相应定量快检卡和黄曲霉毒素稀释缓冲液，平衡至室温。将iCheck 食品安全定 量快检仪自带的零点校正片插入定量快检仪测定室，进行零点校正 将相应批次 的快检卡二维码输入到iCheck 食品安全定量快检仪中，获取校准曲线。将定量 快检卡外包装打开，取出相应微孔固定于微孔架上，快检卡放置于37 ℃ 恒温器 上。取黄曲霉毒素稀释缓冲液120 L 于相应微孔中，加入1. 3. 4项下配制的GICA 法用供试品溶液30 L，用移液器吸打5 次混匀，取100 L 加入到快检卡样品孔中。
37 ℃反应10 min 后，立即将快检卡放入定量快检仪中，点击检测分析读数，即 为样品实际浓度。
1. 4. 2 IAC - HPLC 法使用 1. 3. 3项下配制的吐温/磷酸盐缓冲溶液将免疫亲和柱上杂质除去，精密量 取1. 3. 4项下配制的IAC - HPLC 法用供试品溶液25 mL，以流速2 mLmin - 1 通 过免疫亲合柱，用5 mL 蒸馏水洗脱，并用空气压出柱中残留蒸馏水，用1. 5 mL 甲醇洗脱，甲醇洗脱液置2 mL 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀待HPLC 检测。
色谱条件:采用Cloversil C18色谱柱( 5 m， 4. 6 mm 150 mm) ，以甲醇- 水( 45∶ 55) 为流动相，流速0. 8 mLmin - 1，检测器为荧光检测器，激发波长ex = 360 nm， 发射波长em =440 nm，进样量20 L，光化学衍生化系统为光化学衍生器。使用上 述IAC - HPLC 方法，对供试品溶液进行测定。
2 结果与讨论 2. 1 GICA 方法学验证 抽取3 个批次不同剂型不同标准的样品进行方法学验证: 分别从1、4 和9 号厂家随机抽1 批次样品，编号为A、B 和C，其中C 为水丸。将A、B 和C 3 个批次样品按1. 3. 4项下配制方法制成GICA 法用供试品溶液。使用标准加入法， 在供试品溶液中加入黄曲霉毒素标准品至终浓度分别为0、3. 125、6. 25、12. 5、 25. 0 gkg - 1。按1. 4. 1项下GICA方法进行检测，每批次样品平行重复3 次，结果见表2。A、C 无黄曲霉毒素检出，而B 中黄曲霉毒素总量和AFB1均检出( 最低 检出限3 gkg - 1 ) 。A 和C回收率在73. 0% ～ 105. 0% 之间，符合关于痕量分 析回收率要求范围( 70% ～ 110%) [11]。B 样品回收率为44. 6% ～ 92. 2%，部 分低于60%，说明样品基质干扰较大，不适合用GICA 法检测。
2. 2 IAC - HPLC 法验证 按照1. 3. 4项下方法制备IAC - HPLC 法用供试品溶液，按1. 4. 2项IAC - HPLC 条件测定A、B 和C 3 批次样品中黄曲霉毒素的含量。黄曲霉毒素B1、 B2、G1和G2的最低检出限分别为0. 2、0. 1、0. 3 和0. 3 gkg - 1。使用IAC - HPLC 法对3 批次样品进行检测，所有结果均小于黄曲霉毒素的最低检出限( 表3) 。
与表2 结果进行比对可知，使用GICA法检测B 样品的加入回收率较低，且本底 有黄曲霉毒素检出，而使用IAC - HPLC 法验证时并未检出黄曲霉毒素，推断 GICA 法在检测B 样品时可能存在假阳性结果。在A 和C 样品检测时， IAC -HPLC 方法和GICA 方法均未检出黄曲霉毒素，结果表明在现有分析条件下， 未发现假阳性。
2. 3 实验结果 2. 3. 1 GICA 检测结果 使用GICA 方法分析38 批次样品。实验首先选用黄曲霉毒素总量试剂盒 进行，若有总黄曲霉毒素检出( 检出限gkg -1 ) ，则使用AFB1试剂盒对检测结果 进行分析整理，见表4。所有厂家黄曲霉毒素限量均符合中国药典2010 年版一部 规定，合格率为100%。其中，3个厂家的5 批次样品总黄曲霉毒素和AFB1均有 检出，检出率为13. 16%。
2. 3. 2 IAC - HPLC 验证结果 为了验证GICA 法的准确性，实验中选择了厂家提供的六神曲( 炒) 对照 药材和成药共9 份样品进行IAC - HPLC 检测。六神曲( 炒) 药材2 批次:Ⅰ为5 号厂家，Ⅱ为10 号厂家;
AFB1检出的大蜜丸5 批次:Ⅲ为1 号厂家，Ⅳ和Ⅴ为4 号厂家2 个批次，Ⅵ和Ⅶ为10 号厂家2 个批次;
随机选取未检出黄曲霉毒素的 样品2 批次作为阴性对照: Ⅷ为1 号厂家，Ⅸ为6 号厂家。检测结果见表5。由IAC - HPLC 法检测结果可知，六神曲( 炒)药材( Ⅰ和Ⅱ) 均有黄曲霉毒素检出，其 中Ⅰ中AFB1含量为0. 6 gkg - 1，而对应的5 号厂家的成药中未检出黄曲霉毒素( GICA 法检出限3. 0 gkg -1 ) 。10 号厂家提供的六神曲( 炒) 药材( Ⅱ) 和成药 ( Ⅵ和Ⅶ) 均有黄曲霉毒素检出: Ⅱ中AFB1为2. 1gkg - 1，AFB2为0. 3 gkg - 1 ;
Ⅵ中AFB1为1. 3gkg - 1 ;
值得注意的是，Ⅶ样品的黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2 均有检出，见表5。样品Ⅲ、Ⅵ和V 用GICA 法均有黄曲霉毒素检出，但使用IAC - HPLC法检测并未检出，这与方法学验证中4 号厂家样品的验证结果一致，应 为假阳性结果。
3 结论 牛黄清心丸( 局方) 有29 味药材组成，成分复杂，基质干扰较大。由验 证实验可以看出，GICA 法可以用于牛黄清心丸( 局方) 中黄曲霉毒素的检测。
在验证实验中，A、C 2 个样品的加标回收率符合痕量检测要求，而B 样品蜜丸 发硬现象明显，可能是由于炼蜜的质量较差，从而导致B 样品基质影响较大， 有假阳性结果，须再经过IAC - HPLC 法验证。对38 批次抽样的牛黄清心丸( 局 方) 样品进行检测，有5 批次有黄曲霉毒素检出，检出率为13. 2%，且均为蜜丸。
在前期处理剪碎蜜丸时，这5批蜜丸性状与其他样品有一定区别，譬如蜜丸手感 比较粗糙无细腻滋润感，硬度偏硬，其中4 号和10号厂家的蜡丸表面有明显裂纹。
由实验结果可知，蜜丸制作工艺直接影响GICA 法的结果，但对IAC - HPLC 法 影响不大。所以在对复杂样品的检测中，建议可用GICA 法和IAC - HPLC 法2 种 方法结合验证，从而保证检测结果的准确性。