HPLC法测定左卡尼汀注射液的含量及有关物质的研究
HPLC法测定左卡尼汀注射液的含量及有关物质的研究 左卡尼汀是一种氨基酸衍生物，又称左旋肉碱，是哺乳动物能量代谢必需 的体内天然物质，其作用主要为促进脂质代谢。左卡尼汀注射液在临床上应用广 泛，效果良好，是治疗心力衰竭的首选药物，主要用于慢性肾衰竭及血液透析者 肉碱缺乏性疾病，目前己被美国药典和我国国家药品标准目录收载。但我国现有 制剂标准中，并未设定其有关物质的检查项。目前的研究中，也多以左卡尼汀及 杂质A为主，未见其他杂质的相关报道。我国的新药研究领域，有关物质逐步引 起人们的重视，为提高用药安全性，在研发过程中通常需对原料和制剂中的有关 物质进行详细的研究。欧洲药典和英国药典收载的左卡尼汀原料药质量标准中， 列出了其中常见的4种杂质，即杂质A,杂质B、杂质C和杂质D，但仅对杂质A的 量进行了限定(不超过0.5%)。两部药典中所用色谱柱为丙胺基甲基硅烷基键合硅 胶柱，柱子填料和规格在国内并不常见。经本课题组验证，使用该两部药典中的 色谱条件无法使主峰与杂质A峰完全分离，且无法有效区分杂质B,C和D。故本研 究建立一种可同时用于左卡尼汀含量和各有关物质的测定方法，使左卡尼汀主峰、 杂质A、杂质B、杂质C和杂质D5个色谱峰均能完全分开，以提高药品的质量标 准和安全性，为该品种的研发及质量标准的建立和提高提供保证。1仪器与试药 岛津分析型高效液相色谱仪(二极管阵列检测器、二元高压梯度泵、真空 脱气机、柱温箱、自动进样器;色谱工作站);超声波清洗器(南京垒君达超声电子 设备有限公司);METTLER实验室pH计(梅特勒-托利多仪器有限公司);METTLER XS105型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。
对照品左卡尼汀(批号L0399900)、杂质A(批号L0399905)、杂质B(批号 1418-064A1)、杂质C(批号1394 - 016A2)购于欧洲药品质量管理局，杂质D(批号 MS200705-OS A)购于深圳德博瑞生物科技有限公司，纯度均大于98%;左卡尼汀 原料药(批号0171302002)，购于东北制药集团股份有限公司;左卡尼汀注射液(3批 中试放大注射液由悦康药业集团有限公司生产，其他由北京中医药大学中药现代 研究中心研制)。乙腈为色谱级，水为超纯水，其他为分析纯。
2方法与结果 2. 1溶液的配制2.1.1供试品溶液I 精密吸取左卡尼汀注射液0. 5 mL于50 mL量瓶中，用流 动相稀释并定容至刻度，摇匀，即得。
2.1.2供试品溶液II 精密吸取左卡尼汀注射液0. 5 mL于10 mL量瓶中，用流 动相稀释并定容至刻度，摇匀，即得。
2.1.3对照品储备液分别称取左卡尼汀、杂质A、杂质B、杂质C和杂质D的 对照品适量，精密称定，加流动相制成质量浓度分别为2. 62 , 87. 40 ,56. 00 , 44. 80 和50. 80 g/mL的溶液，摇匀，即得。
2.1.4对照溶液精密吸取供试品溶液II 10 L于10 mL量瓶中，用流动相稀释 至刻度，摇匀，即得。
2. 2色谱条件 采用Alltech Brava Amino色谱柱(250 mm x4. 6 mm, 5m )，流动相为0. 01 mol/ L磷酸盐缓冲液-乙腈(25 : 75 )，流速1. 0 mL/min，柱温为40 ℃，检测波长 205 nm，进样量10 L 。
2. 3系统适用性试验 按上述色谱条件，左卡尼汀峰与杂质峰分离度大于1. 5，理论塔板数按左 卡尼汀计大于3 000。
2. 4专属性考察 分别精密称取5份左卡尼汀原料药适量，置于25 mL量瓶中。取2份分别加 入1.0 mol/L盐酸和1. 0 mol/ L氢氧化钠溶液各5 mL，室温放置1h后中和并加流动 相至刻度;取1份加入30%过氧化氢溶液8滴，室温放置1 h后加流动相至刻度;最后 2份分别加入1.0 mol / L盐酸和1.0 mol/L氢氧化钠溶液各5 mL，放置于烘箱 (57 ℃)0.5 h后中和，加流动相至刻度。上述5份处理过的样品摇匀静置，滤过， 取续滤液进样测定。左卡尼汀原料药在碱加热破坏情况下可产生杂质A，在其他 条件下并无明显杂质出现。各杂质峰与左卡尼汀峰分离良好，表明该色谱条件适 用于有关物质的测定。
2. 5检测限和定量限 将2. 1. 3项下对照品储备液用流动相逐步稀释成不同浓度，注入液相色谱仪，分别以信噪比3: 1和10: 1为标准测定各成分的检测限和定量限。
2. 6线性关系考察 分别精密吸取左卡尼汀及各杂质的对照品储备液，加流动相制成不同浓度 的系列对照品溶液，精密吸取10 L注入高效液相色谱仪，以各自的峰面积A对其 浓度C进行线性回归。结果表明左卡尼汀及各杂质在其各自浓度范围内线性关系 良好。
2. 7精密度试验 2. 7. 1日内精密度按2.1.1项下方法配制供试品溶液16份，按2. 2项下色谱条 件连续进样6次，计算左卡尼汀峰面积的RSD (n =6)为1. 1%。精密量取2.1.3项下 各杂质对照品储备液，分别按2. 2项下色谱条件连续进样6次，结果左卡尼汀、杂 质A、杂质B、杂质C、杂质D峰面积的RSD ( n =6)依次为 1.1%,0.42%,0.98%,1.5%,1.5%。结果表明仪器的精密度良好。
2. 7. 2日间精密度分别精密量取供试品溶液I和各杂质对照品储备液，按2. 2项下色谱条件连续3d进样，每日进样2次，结果左卡尼汀、杂质A,杂质B、杂质 C、杂质D峰面积的RSD (n =6)依次为0.72%,0.30%,12.3%,2.7%,2.1%，结果表明仪 器的精密度良好。
2. 8稳定性试验 精密量取供试品溶液I，室温放置，分别按2. 2项下色谱条件于0,2,4,6,8,12 h 进样测定，结果左卡尼汀峰面积的RSD为0. 22%。表明供试溶液在12 h内稳定。
2.9回收率试验 2. 9. 1左卡尼汀加样回收率取供试品溶液I 3份，分别加入左卡尼汀低、中、 高3种质量浓度(相当于供试品溶液I中左卡尼汀量的80%,100%,120%)的对照品溶 液，摇匀，即得供试溶液。按2. 2项下色谱条件每种质量浓度的供试溶液连续进 样3次，记录色谱峰面积，结果见表2。低、中、高3种质量浓度的平均回收率(n = 9)为100.0% ( RSD =0. 93%)。2. 9. 2杂质A、杂质B、杂质C、杂质D的回收率分别 精密称取杂质A,B,C,D对照品1. 10, 1. 38,1.94,1.58 mg于50 mL量瓶中，用流动相 溶解并稀释至刻度，摇匀，制得各供试溶液(视为浓度100% )。并以此配制 80 % ,120%浓度的供试溶液。每个浓度的供试溶液分别按2. 2项下色谱条件连续进样3次，记录色谱峰峰面积并计算其回收率。结果杂质A、杂质B、杂质C、杂 质D的平均回收率(n=9)分别为100.1% (RSD =0.53%) ,101.6%(RSD=6. 0 %)、 95.7%(RSD=3. 6%)、102.5 %(RSD=2. 1%)。
3含量测定及其有关物质测定 取中试放大的3批左卡尼汀注射液，分别按2.1.1 , 2.1. 2及2.1.4项下方法制 备供试品溶液I、供试品溶液II及对照溶液，按2. 2项下色谱条件进样分析，以外 标法计算左卡尼汀和杂质A含量，以自身对照法计算其他杂质含量. 4讨论 4. 1氨基柱的使用及色谱峰的分离 在本研究所建立的色谱方法中，用前充分平衡色谱柱以及柱温的选择是有 效分离的关键。将氨基柱作为反相色谱柱使用，存在表面键合基团易流失的问题， 故对于新的色谱柱，需使用不含盐的流动相进行24 h以上的平衡，否则会出现保 留时间偏移等问题;另外，柱温对左卡尼汀和杂质A的分离度有明显的影响，在柱 温40℃时，两者的分离度可达到1. 5以上，实现完全分离。而在美国药典中，两 者所规定的分离度为1.20 4. 2缓冲盐浓度的选择 文献[报道左卡尼汀分析方法对流动相的pH要求严格，需调节至4. 70使用， 故流动相宜采用缓冲盐系统。在本研究中，对比了不同浓度的磷酸盐缓冲液(0. 01~0. 05 mol / L)，结果发现，在未调节pH的情况下，缓冲盐浓度对出峰情况没 有明显的影响。从节约色谱柱和仪器寿命角度考虑，本实验选择了0. 01 mol/ L 的磷酸盐缓冲液。这是目前己有报道的左卡尼汀分析方法中磷酸盐浓度的最低值。
4. 3色谱条件的确定 研究过程中曾采用国家药品标准左卡尼汀注射液含量测定方法，常规C,、 色谱柱，使用离子对试剂作为流动相，将混合对照品溶液注入高效液相色谱仪， 结果发现左卡尼汀与杂质A分离度较差，杂质B、杂质C和杂质D与溶剂峰混在一 起，无法分离，且流动相的配制较烦琐。故在本研究中，最终采用常规氨基柱， 在对柱温(30,35,40 ℃)、流速(0. 8 ,1.0,1.2 mL /min)、水相比例(20%,25%,30%,35%) 进行对比研究的基础上，确定了2. 2项下色谱条件。5结论 本文建立了优化的左卡尼汀注射液含量测定和有关物质检测的HPLC法， 并对该方法进行了完整的方法学验证。通过以上试验结果表明，所建方法专属性、 精密度、线性与范围、准确度均符合要求，能够准确地对左卡尼汀注射液进行含 量测定及有关物质的分析。该方法克服了国外药典中色谱柱不易得、国家药品标 准中流动相配制烦琐、杂质B,C,D分离度不好等多个问题，可使左卡尼汀及4个相 关杂质峰得到较好分离和定量测定，可为左卡尼汀注射液质量控制和质量标准的 建立提供可靠手段。