对遗传学诊断的分析思考
对遗传学诊断的分析思考 近二十年来，分子遗传学的一系列成就，不仅推动了分子生物学和基础医 学的发展，而且对遗传疾病的诊断和治疗，也应用了分子遗传学的新技术如分子 杂交、内切酶、DNA重组等进行了探索，并获得了有意义的结果。生物遗传的基 本单位是基因，其遗传信息贮存在DNA(去氧核糖核酸)分子的碱基序列之中。结 构基因就是决定特殊蛋白质遗传密码的DNA的一个片段。一、运用单细胞双重巢式PCR和MDA技术方法行性连锁遗传病诊断 方法1、提取男女单个淋巴细胞各150例，共300个细胞。随机分成3 组，每组男女细胞各50个，双重巢式PCR技术在单细胞水平同时扩增X-类固醇硫 酸脂酶基因(steroid sulfatase gene， STS)/Y-假基因和牙釉质基因(Amelogenin， AMEL)，对照组用单重巢式PCR技术在单细胞水平分别扩增两基因，比较单、双 重巢式PCR技术在单细胞水平的扩增率及性别诊断正确率。2、应用MDA扩增5 个单个淋巴细胞和10个单个卵裂球全基因组DNA，1%的琼脂糖电泳检测扩增效 率，通过普通PCR即上述巢式PCR的第二轮的PCR条件检测细胞性别来判断扩增 产物的均一性。结果1、单重巢式PCR扩增男性细胞STS和AMEL的扩增率和细胞 性别诊断的正确率分别是84%、76%和84%、84%;而双重巢式PCR技术同时扩增 上述基因的扩增率和性别诊断正确率分别为98%、96%。后者与前两者相比扩增 率和性别诊断正确率均明显提高，差异均有统计学意义(P0.05、P0.01)。2、MDA 扩增5个淋巴细胞(3个为男性细胞，2个为女性细胞)全部扩增成功，扩增率 100%;MDA扩增10个卵裂球有4个扩出产物，扩增率为40%。以MDA产物为模板， 用STS的第二轮引物检测单个淋巴细胞性别，正确性为100%;检测所有扩出产物 的卵裂球也均能检测出性别，发现2个为男性，2个为女性，可惜的是这4个卵裂 球均来自不同的胚胎，所以不能相互验证。从淋巴细胞MDA产物检测的结果可 以判断MDA产物也是均一的。结论1、在单细胞水平性连锁遗传疾病诊断中，双 重巢式PCR技术较单重巢式PCR技术具有较高的扩增率及诊断正确率，并有助于 发现等位基因脱扣(allele dropout， ADO)。该法在无创性单基因伴性遗传病的产 前诊断和植入前遗传学诊断中具有较高的实际应用价值，且经济、便捷，值得临 床进一步推广。2、初步预实验可知MDA可以克服单细胞的模板量少和不可重复 实验的缺点。但由于此次预实验的样本量太小，其稳定性、可靠性还需进一步摸 索，才可以用于单基因病的着床前遗传学诊断和产前诊断。
二、利用孕妇外周血浆中小片段游离胎儿DNA进行无创性地中海贫血产前基因诊断的研究 方法：收集157例孕妇的外周血，利用柱吸收的方法提取血浆中的 cffDNA，经琼脂糖凝胶电泳分离富集小片段cffDNA，使用二重PCR反应 (dulex-PCR)检测SRY基因和磷酸甘油醛脱氢酶 (glycerol-dehyde-phosphatedehydrogenase，GAPDH)基因。结果来源于86例孕男胎 的孕妇血浆标本的小片段cffDNA均检出SRY和GAPDH基因，来源于71例孕女胎 的孕妇血浆标本的小片段cffDNA只检出GAPDH基因。与绒毛/羊水标本检测结果 以及产后随访结果相符。特异性和敏感性分别为100%(157/157)和100%(86/86)。
结论利用琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，可以选择性富集孕妇外周血中的小片段 cffDNA，相对地提高胎儿DNA的含量，结合二重PCR扩增SRY基因技术可用于 无创性产前性连锁遗传疾病和单基因突变疾病的产前诊断。第二部分利用孕妇外 周血浆中cffDNA进行STR-PCR检测胎儿基因型目的：利用小片段cffDNA进行 D5S818、D7S820、D13S317三个短串联重复序列(short tandem repeat，STR)基因 型的分析，观察提取出来的小片段cffDNA中母源性DNA背景对实验的影响。方 法：收集了62例孕妇外周血标本，提取小片段游离胎儿DNA，利用多重 PCR(mutilplex-PCR)的方法分析胎儿的STR基因型，并与父母基因型相比对。结 果：62例小片段cffDNA的扩增结果中，49例标本的扩增结果完全与父母基因型 相匹配，未发现母源性DNA的污染。其余13例在D13S317基因座的扩增中出现了 母源性DNA的污染。结论：经过对小片段cffDNA进行富集后，仍有可能出现母 源性DNA对实验的影响，并且可能影响对实验结果的判读。使用多重PCR反应结 合多基因座的扩增，可能可以有助于减少母源性DNA的影响，有助于结果的判 读。第三部分利用孕妇外周血浆中小片段游离胎儿DNA进行β-地中海贫血无创性 产前基因诊断目的：利用cffDNA对胎儿进行广西、广东地区常见的17种β-地中 海贫血基因型的检测，与传统创伤性产前诊断相比较，探讨该方法的准确性和可 行性。方法：针对广西、广东地区常见的β-地中海贫血突变的基因型设计三对不 同引物，并用生物素标记。对cffDNA进行二次PCR反应后，使用反向斑点杂交 (revert dot-blot hybridization，RDB)检测胎儿的β-珠蛋白基因型，与创伤性产前诊 断结果比较，观察准确率。结果：37例cffDNA标本检测中，检出重型β-地中海 贫血19例，轻型β-地中海贫血11例，正常7例，与创伤性产前诊断结果相比较出 现3例误诊，准确率为91.9%(34/37)。结论：利用cffDNA进行β-地中海贫血的检 测，可能出现母源性DNA背景的污染，当胎儿基因型与母亲基因型相同时，必 须提高警惕，进一步分析或者复查。因为该技术取样容易，对孕妇胎儿无风险， 不受孕期时间影响，易为与孕妇接受，因此进一步改进该技术后有望可用于β- 地中海贫血的诊断。第四部分利用孕妇外周血浆中小片段游离胎儿DNA进行巴氏水肿胎儿检测目的：通过检测cffDNA以及母源性cfDNA在PCR反应中扩增效率 的不同，进行检测巴氏水肿胎儿(Hb Bart’s hydrops foetus)的方法学研究。方法：
对来源于拟诊孕水肿胎儿孕妇的小片段cffDNA，进行荧光PCR(Fluorescence PCR)扩增，利用毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)技术判断两种产物峰面 积比(peak area ratio)来检测巴氏水肿胎儿。结果：30例拟诊巴氏水肿胎儿的小片 段cffDNA扩增结果提示，巴氏水肿胎儿两种产物锋面积比远远1。而其他原因所 致的水肿胎儿的cffDNA模板扩增结果显示两种产物封面值比近似等于1。结论：
通过荧光PCR和毛细管电泳的方法，有望利用cffDNA进行巴氏水肿胎儿的无创 性产前诊断。
作者：王谷仙 严璟 来源：人间 2016年21期