少腹逐瘀汤对气虚血瘀模型大鼠红细胞膜组分的影响研究
少腹逐瘀汤对气虚血瘀模型大鼠红细胞膜组分的影响研究 少腹逐瘀汤亦出自王清任《医林改错》，王氏治疗血瘀常用桃仁、红花、 赤芍、当归、川芎等辛温或辛而微温之品。以温为主少用药性偏凉的活血祛瘀药 物，体现王氏治疗瘀血偏于温散的特点，这与中医认为血属阴，得温则行，得寒 则凝的思想有关。少腹逐瘀汤中药物配伍亦是如此。方中诸药相伍，温经活血， 散寒止痛，以治疗寒凝气滞，瘀血结于少腹胞宫之诸证。对于血瘀证研究而言，虽然有关中医宏观辨证和西医微观辨证的冲突方面 的争论一直存在，但不可否认的是作为目前中西医研究衔接较好的证候，有关血 瘀证在血液流变学、微循环、血液动力学方面的异常已得到公认。因此，以气虚 血瘀大鼠模型，从血液流变学及红细胞膜组分变化探讨少腹逐瘀汤改善气虚血瘀 的作用机制，为血瘀证相应方药药理作用及作用机制的研究提供更为客观的依据。
材料 1. 动物 清洁级雄性Wistar老龄大鼠40只，雌雄各半，体质量（27519）g， 由黑龙江中医药大学实验动物中心提供[动物合格证号SCXK（黑）2008004]。
2. 药物 少腹逐瘀汤由当归9g，赤芍6g，川芎6g，延胡索3g，蒲黄9g，干 姜3g，肉桂3g，小茴香1.5g，没药3g，五灵脂6g 组成，上述十味药，加10倍量 水浸泡0.5h，加热回流煎煮2次，第1次1.5h，第2次1.0h，合并煎煮液，浓缩成浓 度为4.8g/kg的少腹逐瘀汤备用。
3. 仪器 Anthos 2010酶标仪（郑州博赛生物工程有限责任公司）， BECKMAN低温超速离心机（美国贝克曼库尔特有限公司），LBY-N6B型血液 黏度仪（北京普利生仪器有限公司），LBY-BX型红细胞变形仪（北京普利生仪 器有限公司），TGL-16G型高速台式离心机（上海医用分析仪器厂），Waters 2695 高效液相色谱仪（美国Waters公司），蒸发光散射检测器ELSD2000（美国Alltech 公司），LBY-XC全自动动态血沉测试仪（北京普利生仪器有限公司）。
4 . 试 剂 巯 基（南 京 建 成 生物工程研 究 所，批号20120503）；
唾 液酸（由南京建成生物工程研究所，批号20120503）；
丙二醛（malonaldehyde, MDA）（南京建成生物工程研究所，批号20120423）；
Na+-K+-ATP酶（南京建 成生物工程研究所，批号20120428）。方法 1. 分组及给药 40只大鼠按体质量随机分为4组，即少腹逐瘀汤高剂量组 （4.8g生药/kg）、少腹逐瘀汤低剂量组（1.2g生药/kg）、模型组（蒸馏水）和空 白组（蒸馏水）。其中除空白组给予正常饮食饮水外，正式造模前1d禁食不禁水， 之后每天置于水深（301）cm，水温（402）℃水槽中，力竭游泳。当大鼠出现 自然下沉（头没入水面超过5s）为终止信号，将大鼠取出烘干。每天力竭游泳后 再给正常饮食量的1/3饲养，每天每只大鼠按照40g/kg喂食，每日1次，连续14d。
末次造模后禁食不禁水12h。
2. 红细胞膜的制备 取新鲜肝素抗凝血2mL以及枸橼酸钠抗凝血6mL。其 中枸橼酸钠抗凝血以3 000r/min离心10min，弃上清液，除去中间的白细胞和血小 板层，再以1∶3比例加入等渗pH值7.4 PBS，3 000r/min离心10min，弃上清液， 反复洗涤3次，最终得到干净的红细胞。按照1∶80比例向红细胞中加入预冷的 5mmol/L pH值7.4 Tris-HCl溶液，同时加入0.1mmol/L蛋白酶抑制剂PMSF（对甲 苯磺酰氟），超声15min（80Hz，20℃），放入4℃冰箱过夜使其充分溶血。红 细胞溶血液以15 000r/min离心10min，弃上清液，加入5mmol/L pH值7.4 Tris-HCl 溶液以15 000r/min离心10min，反复洗涤3次，最后得到乳白色膜，将其1∶1悬浮 在PBS溶液中，膜蛋白定量后置于低温冰箱备用。
3. 血液流变学指标检测 3.1 全血黏度的测定：取肝素抗凝血1mL，用LBY-N6B型血液黏度仪测定 全血黏度。
3.2 血浆黏度的测定：取肝素抗凝血1mL离心（3 000r/min，10min），取 血浆用于血浆黏度测定。
3.3 红细胞变形性的测定：取肝素抗凝血20L，加入15%PVP悬浮液1mL中 混匀，吸取500L采用LBY-BX型红细胞变形仪进行测定，剪切参数分别为600、 800、1000s-1。
4. 红细胞膜组分变化 4.1 红细胞膜胆固醇含量测定 取制备好的红细胞膜液0.5mL，加入2.5mL 提取液（氯仿∶甲醇=2∶1），向膜液中每加入0.5mL涡旋振荡器剧烈振荡混匀， 直至全部加完后，避光室温静置2h，取下层有机层2mL，作为供试品溶液。4.2 红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性测定 采用比色法测定红细胞膜上 Na+-K+-ATP酶活性。
4.3 红细胞膜唾液酸及巯基含量测定 根据试剂盒说明书检测红细胞膜上 唾液酸及巯基含量。
4.4 红细胞膜MDA水平检测 根据试剂盒说明书检测红细胞膜上MDA水 平。
5. 统计学方法 采用SPSS 16.0软件处理所得数据，选用One-way ANOVA 进行统计分析，数据以x-s表示。以P0.05为差异有统计学意义。
结果 1. 造模前后大鼠身体表征及体质量变化 见表1。造模后，模型组大鼠体 质量显著下降，毛色暗淡无光易脱落，倦怠，便溏。与自身造模前比较，模型组 及给药组体质量均明显下降（P0.01）；
空白组体质量显著上升（P0.01）。
2. 对气虚血瘀大鼠血液流变学指标的影响 见表2。与空白组比较，模型 组大鼠全血黏度及血浆黏度显著升高（P0.05，P0.01），红细胞变形指数显著降 低（P0.01）。少腹逐瘀汤高剂量能够显著降低3s-1、30s-1和200s-1切变率下全血 黏度（P0.01，P0.05），降低血浆年度（P0.01）。
3. 红细胞膜组分变化 结果见表3。与空白组比较，气虚血瘀组 Na+-K+-ATP酶活力、唾液酸含量及巯基含量均显著降低（P0.05，P0.01），MDA 含量和膜胆固醇含量均显著升高（P0.05）；
与模型组比较，少腹逐瘀汤高剂量 组可显著升高Na+-K+-ATP酶活力、唾液酸含量以及巯基含量（P0.05），低剂量 组显著降低MDA含量（P0.01）。
讨论 少腹逐瘀汤温经活血，散寒止痛，以治疗寒凝气滞，瘀血结于少腹胞宫之 诸证。广泛应用于妇科痛经、盆腔炎、妇科肿瘤等治疗。少腹逐瘀汤对正常雌性 大鼠离体子宫自发运动的收缩和舒张强度有抑制作用。血液流变学方面，少腹逐 瘀汤可改善冰水浴与肾上腺注射所致寒凝血瘀 SD大鼠全血黏度、血浆黏度、血 沉、红细胞压积，调节雌二醇（E2）和孕酮（P）水平，对ADP诱导血小板聚集 和凝血酶时间有显著影响。实验结果表明，少腹逐瘀汤高剂量可有效改善气虚血瘀模型大鼠全血黏度， 这与方中的川芎、赤芍、当归等药物在现代药理研究中有改善血液黏度作用有关。
细胞水平上，少腹逐瘀汤可显著升高Na+-K+-ATP酶活力、唾液酸和巯基的含量， 显著降低MDA含量。红细胞膜表面的Na+-K+-ATP酶能够维持红细胞正常形态， 其活性降低会使红细胞内失K+增多，水分将随Na+进入胞内，而使红细胞体积增 大，甚则如球形而水肿破裂。反之活性升高可使红细胞变形性得到改善；
唾液酸 是红细胞膜表面负电荷的主要来源，负电荷之间的相互排斥可以防止细胞间相互 聚集，若唾液酸含量减少，使红细胞聚集性增加。因此，增加唾液酸含量可以抑 制红细胞的聚集，改善低切变率下的全血黏度的变化。巯基存在于细胞膜表面， 是一种极易受到自由基等因素影响的重要的膜蛋白功能基团，可保护细胞膜免遭 过氧化损伤。如果膜蛋白分子通过巯基氧化缔合交联，则其构象变化将受阻，导 致膜变形性降低；
红细胞膜MDA的含量体现了被氧化程度。少腹逐瘀汤可增加 巯基含量并降低MDA含量，都起到清除自由基，抗氧化的作用，因此两者也是 相一致的。由此笔者推断少腹逐瘀汤可能是通过提高Na+-K+-ATP酶活力、唾液 酸和巯基含量，而增加红细胞膜表面负电荷，增加抗氧化性，减轻自由基对红细 胞攻击程度，改善红细胞的变形性，达到改善气虚血瘀模型大鼠血瘀状态。