哺乳动物胰岛素样生长因子酸不稳定亚基的结构
哺乳动物胰岛素样生长因子酸不稳定亚基的结构 胰岛素样生长因子(Insulin-likegrowthfactors,IGFs)信号系统在动物胚 胎、胎儿的生长发育和骨的成熟中发挥着重要作用。IGFs信号通路不仅是正常组 织细胞代谢的基础’也对恶性细胞的增殖、分化、凋亡和转移起着重要的调节作 用，与许多癌症(如乳腺癌)的发展紧密相关；同时，IGFs系统还参与了一些代谢 综合征与心血管疾病的发生过程[6]。游离的IGFs(包括IGF-1和IGF-2)的半衰期非 常短，仅为10min，不足以维持其到达靶器官发挥作用，即使与胰岛素样生长因 子结合蛋白-3(Insulin-likegrowthfactorbindingprotein-3,IGFBP-3)结合形成异源二 聚体后，其半衰期也只增加了3~9倍，但是当这种异源二聚体和胰岛素样生长因 子酸不稳定亚基(Insulin-likegrowthfactoracid-labilesubunit,IGFALS)结合形成异源 三聚体后，其半衰期会显著延长，提高到原来的70多倍。因此，IGFs在合成分泌 后主要以异源三聚体的形式存在，并通过血液循环系统运送到动物体内的各个靶 器官，然后解离成游离的分子从而顺利的发挥其调节作用。
尽管早在1992年/GE4以基因的cDNA序列就巳经通过克隆获得，但是 与IGFs系统的各种配体、受体和结合蛋白的研究程度相比，有关IGFALS功能的 研究却一直局限于其延长IGFs半衰期方面[1"而在其他方面，如IGFALS影响IGFs 对靶组织的功能，其详细的作用机制一直缺乏深入的研究。鉴于此，本文综述了 IGFALS的基因结构及生物学功能的研究进展，以期为/GMZS基因功能的深入研 究及应用提供参考。
1IGFALS基因结构及编码的氨基酸序列 1992年，Leong等利用人类肝脏来源的cDNA文库，首次分离、克隆 得到/GMM基因的cDNA序列，该序列共编码578个氨基酸的成熟肽并含有27个氨 基酸的信号肽(图1)。几乎同时，Dai和Baxter[11]以人IGFALS的cDNA序列作为探 针又克隆出大鼠/GF4LS的cDNA序列，该序列长3.5kb，包含2个外显子(16bp、 1796bp)和1个内含子(1116bp)，其中外显子1编码前5个氨基酸和第6个氨基酸的第 一位，外显子2编码第6个氨基酸的后两位和剩余的599个氨基酸。
随后，/GiALS基因的全长序列又在小鼠上被克隆并被定位到小鼠17 号染色体A2-A3区带。小鼠/GFALS基因大小约为3.3kb，由2个外显子(16bp、 2060bp)和1个1126bp的内含子组成。IGFALS氨基酸序列包含18~20个由24个氨基 酸残基组成的亮氨酸残基富集基序，这些重复序列占了IGFALS成熟肽的80%。
亮氨酸残基富集基序成串排列，构成了IGFALS蛋白的主体结构，参与蛋白-蛋白间的相互作用，可与IGFBP-3或者IGFBP-3和IGF形成的二聚体结合。
近年来，有关家养动物IGFALS的研究也陆续被报道(表1)。绵羊 /GFALS基因的序列全长为3.0kb，包含2个外显子(16bp、1957bp)和1个977bp的内 含子，与人、小鼠/GFALS基因的序列相似性分别为80%和75%。绵羊IGFALS氨 基酸序列包含18个由24个氨基酸残基组成的亮氨酸残基富集基序，12个半胱氨酸 残基，其中11个的分布位点和人IGFALS相同。猪/GFALS基因的全长为2990bp， 包含2个外显子(53bp、1947bp)和1个长度为990bp的内含子，其编码区长度为 1775bp，与人、大鼠、小鼠以及狒狒/GFALS的相似性分别为54%、79%、79%和 84%。基因编码606个氨基酸，信号肽长度为26个氨基酸，成熟肽则由580个氨基 酸组成，猪的成熟IGFALS蛋白和人、大鼠、小鼠的相似性分别为74%、71%和 71%，包含21个亮氨酸残基富集基序。牛/GFALS基因的成熟mRNA序列共编码 611氨基酸，其中信号肽包括32个氨基酸，成熟肽包括579个氨基酸，共有12个半 胱氨酸残基，主要集中在C-端和N-端。另外，牛的成熟IGFALS蛋白也包含20个 亮氨酸残基富集基序。
总之，IGFALS基因在不同物种之间具有较高的保守性，其保守程度 与物种的亲缘关系成正相关。
另外，IGFALS基因的启动子序列中包含了多个转录因子结合位点， 如HNF-5、PEA3、Spl和干扰素激活序列。值得注意的是，小鼠、大鼠、绵羊和 人的IGFALS基因5"端启动子序列中都没有TATA框和GC框。
1IGFALS蛋白的生物学特征 1.1IGFALS结构特征 人IGFALS蛋白大小为85kDa，包括65kDa核心肽和20kDa糖基化肽。
巳有的研究揭示，IGFALS对游离的IGF-1和IGF-2无亲和力，对游离的IGFBP-3 只有非常低的亲和力;但是，IGFALS却极容易与IGFs和IGFBP-3组成的异源二聚 体结合形成异源三聚体复合物。IGFALS的结合能力表现出对酸碱环境的敏感性， 在酸性条件下(pH4.5)，IGFALS异源三聚体会被不可逆的破坏，这也是IGFALS 得名的缘由。另外，IGFALS与IGFBPs的结合具有特异性：IGFBP-1/-2/-4/-6不能 代替IGFBP-3和IGFALS形成三元复合物；
而IGFBP-5在基因序列和蛋白质结构上 都与IGFBP-3具有最高的相似性，因而也能够和IGFALS结合形成异源三聚体；
但是，与IGFBP-3不同，IGFBP-5能够在缺少IGF的情况下与IGFALS发生微弱结 合。IGFBP的功能域替换实验表明，IGFBP-3/5的羧基端是结合IGFALS的重要部 件，结合活性中心则是由18个氨基酸组成的保守区域，并分别对应IGFBP-3的第 201~218个氨基酸和IGFBP5的第215~232个氨基酸。另外，Twigg等的研究表明在 羧基端区域缺失的情况下，IGFBP-5的中间区域也具备结合IGFALS的能力。
IGFALS蛋白在不同哺乳动物之间具有较高的保守性。例如，小鼠和 大鼠的成熟IGFALS蛋白相似性高达93%，与人和绵羊IGFALS蛋白的相似性分别 为79%和73%。其中，不同物种IGFALS的结构中拥有完全保守的区段，包括1个 由12~13个半胱氨酸残基组成的区段、6~7个天冬酰胺串联的糖基化位点和18~20 个由24个氨基酸残基为单元的亮氨酸富集区域。亮氨酸富集区域约占整个成熟肽 的75%，并使IGFALS形成了内圈直径为1.7nm、外圈直径为7.2nm、厚度为3.6nm 同心圆环的空间结构。由于富含亮氨酸，IGFALS蛋白的表面带负电荷。这些带 负电荷的残基均匀地分布在同心圆环状结构的内表面，能够和IGFBP-3中的正电 荷相互作用。它们和IGFALS蛋白中7个与N端相连的低聚糖附着位点一起，很可 能提供了和IGF-1/IGFBP-3异源二聚体相互作用所必须的静电位，继而在形成异 源三聚体的过程中起到非常重要的作用。Janosi等研究也表明，人IGFALS基因中 的7个与N相连的多糖附着位点的任意一个发生独立突变，不会消除它和IGFBP-3 形成异源三聚体的能力，但是全部都去糖基化就会使其失去这个能力。简言之， 上述结果符 合IGFBP-3/5上带正电荷并具有保守性的由18个氨基酸组成的区域 和IGFALS上带负电荷的区域相吸引的结构特点。
1.2IGFALS的分布及表达量特点 IGFALS在动物体的合成与分布具有组织特异性。虽然IGFALS能够在 某些组织中自由地合成，但其主要合成部位来自肝脏的浆细胞。尽管巳经在动物 腹膜、滑膜、卵巢中检测到中低浓度的IGFALS，而在动物脑脊液、羊水、乳汁、 淋巴液等组织中也检测到极低浓度的IGFALS;但是IGFALS主要存在于动物血液 中。了3恥^等采用更为敏感的检测方法如原位杂交和表达序列标签在肾脏、泌乳 乳腺、胸腺和肺脏等肝脏外的组织中检测到了IGFALS的表达。而Wandji等在猪 卵巢的膜细胞和颗粒细胞中也探测到了/GFALSmRNA。这些发现表明IGFALS可 能在上述组织发挥一定的作用，但其具体功能有待于进一步研究和揭示。
IGFALS蛋白的表达丰度在哺乳动物出生前后以及出生后的不同年龄 阶段呈现出明显的变化。在动物出生前，IGFALS的表达量非常低；
出生后，其 表达量迅速升高。例如，大鼠在出生后，血液中的IGFALS蛋白水平快速上升，从大鼠出生到初情期，血液中IGFALS的浓度增加了5倍，成熟期时达到峰值并维 持稳定状态，从而确保IGFs能够不断地被结合成150kDa的复合物，此时的浓度 为570nmol/L；
在老年大鼠体内，其浓度有所下降。在绵羊中，IGFALSmRNA的 丰度在出生前也很低，但在出生后的7d内突然增加[13]。这种表达模式的出现可 能是因为在绵羊出生前，IGF-1主要是以50kDa的复合物形式存在，而在出生后1 周内主要是以150kDa复合物形式存在。另外，动物出生后，IGFALS的含量随着 GH分泌物和肝脏细胞的GH受体的增加而上升。在循环系统中，IGFALS除了以 异源三聚体的形式存在外，过量的部分还以游离的形式存在，约占其总量的 50%~60%。
2IGFALS的生物学功能 2.1延长IGFs的半衰期 目前的研究巳经明确，IGFALS具有通过与IGFs-IGFBP-3/5结合形成 异源三聚体蛋白复合物从而延长IGFs在血液中半衰期的功能。在哺乳动物血液中， 游离的IGFs的半衰期仅为10min左右，而IGFs-IGFBP-3/5异源二聚体的半衰期则 延长至到30~90min，当上述异源二聚体与IGFALS结合形成异源三聚体后，IGFs 的半衰期则超过12h，是游离状态的72倍。尽管如此，在蛋白水解作用以及 IGFBP-3和异源三聚体相互作用下，三聚体会自主分解释放出IGFs，从而导致血 清中IGFs的异源三聚体和游离的IGFs分子的保持动态平衡，使得二者的比例维持 稳定。
传统的观点认为，IGFALS不是调节IGFs的重要因素，因为相对于动 物血液中过量的IGFs和IGFBP-3，IGFALS的含量较少。但这一观点可能需要修 正，因为IGFALS与IGFBP-3和IGFs结合成复合物的缔合常数(Associationconstant) 很低[18]。这一点在LoriUeki的研究中同样得到了验证，与正常小鼠比较，在 /GFALS缺失杂合子的小鼠血液中，IGFALS的血浆浓度很低，IGF-1的浓度降低 了17%，IGFBP-3的浓度降低了40%。
除了能延长IGFs半衰期，IGFALS还具有阻止IGFs非特异性的代谢效 应功能(如造成严重的低血糖症状)。这主要是由于以异源三聚体形式存在的IGFs， 其分子量较大，无法透过毛细血管壁去激活胰岛素受体；
而异源二聚体和游离的 IGFs却由于分子量很小，可自由穿过毛细血管壁，从而进一步发挥其生物学功能。
2.2IGF-1和IGFBP-3在血清中累积的必要条件相关研究表明，IGFALS是动物血清中IGF-1和IGFBP-3累积的必要条 件。Ueki等聞基于IGFALS缺失小鼠模型的研究发现，/GFALS基因的失活导致 IGF-1/IGFBP-3/IGFALS异源三聚体的缺失。另外，相对于野生型小鼠，/GFALS 缺失的小鼠体内循环系统中的IGF-1和IGFBP-3的浓度也明显的降低。在敲除 /GFALS基因的小鼠模型中，其循环系统中完全没有IGFALS，IGF-1的血浆水平 下降了62%，IGFBP-3的血浆水平下降了88%。但是在该小鼠模型中，IGF-1和 IGFBP-3在肝脏中这些基因的表达和合成的主要位点均正常。此研究结果进一步 说明IGFALS在血清中积蓄IGF-1和IGFBP-3是必需的成分。
2.3IGFALS对动物生长发育的影响 虽然多种动物的/GFALS基因序列巳经被克隆获得，但是关于IGFALS 的分子作用机制及功能却鲜有报道，而且这些研究主要集中在人及小鼠上。近年 来，日渐增多的人类临床医学报道表明，/GFALS基因序列的突变会导致儿童出 现各种发育迟缓和生长缺陷，这进一步体现了IGFALS的重要生物学功能。Dome 沾等最早发现当点突变造成的/GF4ZS基因失活后，血液中的IGF-1、IGFBP-3及 IGFALS的含量非常低，且该病例表现出身材矮小、青春期的推迟、产生一定程 度的胰岛素和生长激素抗性。随后，有关IGFALS的国际合作研究团队又陆续发 现20多例关于IGFALS与生长发育迟缓的相关性的临床病例，这些个体的平均身 高低于同期正常儿童身高的2倍标准差。
Dome沾等于2005年报道了/GFALS基因缺陷在人类和小鼠上有着许 多相似的表型效应，进一步表明IGFALS的功能在哺乳动物生长发育中的重要性。
而Courtland等利用/GAFLS基因敲除小鼠，揭示/GFALS基因缺失对小鼠的体尺和 骨头大小具有性别特异性效应。敲除/GFALS基因的小鼠也表现出股骨骨膜延迟、 皮质厚度和骨总量减少[36,37]。最近，根据小鼠模型实验，Flannery等p8]建议将 IGFALS作为临床医学上检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)对人体 生长抑制作用的生化标志物。
此外，〇肋等[39]利用3000~5000头瑞士褐牛公牛的样本群体，采用 全基因组关联分析(GWAS)定位到牛25号染色体上包含IGFALS的2Mb长度的基 因组区域与牛体高、泌乳量、乳脂率等多个数量性状呈现全基因组水平的显著性 关联。而二比等_以秦川牛作为样本群体，采用候选基因方法，进一步发现IGFALS 与牛体高存在显著性关联。有关家养动物的研究进一步体现出IGFALS在哺乳动 物体内的重要生物学功能。郑凯迪[41]通过对斑马鱼的研究发现IGFALS能够促进卵母细胞的成熟，将注射的pALSMT质粒浓度提高到50ng/^L时，斑马鱼卵母 细胞的成熟率迅速升高到95%左右，而注射空质粒并没有对斑马鱼卵母细胞的成 熟造成影响。他同时指出，哺乳动物卵巢的/GFALS基因表达与斑马鱼类似，都 是在滤泡层细胞中高表达。
3IGFALS的表达调控 3.1mRNA水平的调控 现有研究表明，生长激素(Growthhormone,GH)可能是/GFALSmRNA 合成和血浆IGFALS合成的诱导物。Aguiar-Oliveira等发现完全缺乏GH的状态下 血浆中几乎不含有IGFALS；
另外，IGFALSmRNA出现和肝脏中功能性的GH受 体的出现还具有时间关联。上述结果进一步支持了GH是IGFALS诱导物的观点。
Ooi等研究发现，在肝脏中GH的这种作用发生在/GFALS基因的转录 水平。他利用小鼠肝脏细胞，鉴定出1个应答GH的启动子，并通过删除和突变分 析将该元件定位到小鼠/GFALS基因633~625nt，大小为9bp。该序列被称为 ALSGASi，因为它与y干扰素激活序歹1J(y-interferonactivatedsequence,GAS)一致。
GH对/GFALS基因的效应通过JAK-STAT通路调节：酪氨酸激酶JAK2被募集继而 激活GH受体形成二聚体，使信号转换器磷酸化，同时转录活化因子STAT-5a和 STAT-5b。二聚作用后，STAT5同分异构体在核的位置发生变化，通过结合 ALSG4Si元件来激活/GFALS基因的转录。GH的信号通路诱导/GFALS基因的转 录增加很大程度上依赖于STAT5同分异构体的激活，而无需Ras蛋白的激活，因 为共转染STAT-5a和STAT-5b的显性失活突变体能消除GH对细胞的刺激；
然而， 用Am基因的显性失活突变体和成型活化的Ras进行共转染不会引起类似的作用。
关于人类和绵羊IGFALS基因的研究则进一步证实GH激活IGFALS基 因的机制。尽管小鼠、大鼠、绵羊和人的IGFALS基因的近端序列的相似度不高， 但是它们的ALSGAS1元件在序列和位置上都具有高度的保守性。当被转染到肝 脏细胞中，人和绵羊IGFALS基因的启动子也都会响应GH，而这种响应能力也需 要ALSGAS1元件的存在。上述发现支持了GH刺激IGFALS基因的转录的机制。
白细胞介素-1P(IL-ip)能够通过阻碍IGFALSmRNA的转录来抑制其表 达，但这种阻碍作用只有在GH诱导时才存在。在原代肝细胞中，白细胞介素-1 卩会阻止IGFALS对GH的应答。这种效应的部分原因是由于其下调了GH受体的 表达量。另外，白细胞介素-1P也可降低GH对IGFALSmRNA转录的促进能力，同时也能降低IGFALS启动子的活性。在IGFALS作为GH调节基因转录的模型中， 白细胞介素-1P也表现出干扰STAT5的活性。这种干扰通过细胞因子信号抑制物 3(Suppressorofcytokinesignaling3,SOCS-3)来调控，它是JAK-STST通路的一个抑 制因子，这也许是机体在炎症疾病过程中表现抵抗GH的重要机制。
3.2蛋白质合成和分泌的调节 在大鼠和人类的研究中，禁食、营养不良和代谢疾病(如糖尿病、烧 伤、肝硬化)等外界或动物体内在生理特征的变化都会导致血清中IGFALS的减少。
IGFALS的负调控发生在转录水平，也可以发生在转录后水平。地塞米松、cAMP 和表皮生长因子主要通过降低IGFALS的转录水平降低大鼠原代肝细胞的 IGFALS浓度。例如，当受到热损伤或肝功能衰竭时，糖皮质激素、细胞的cAMP 的增加导致IGFALS的合成量显著下降。相反，胰岛素不足可能是在禁食、营养 不良和糖尿病时引起血清中IGFALS浓度下降的主要原因。胰岛素的这种效应发 生在转录后，因为在原代肝细胞中，在IGFALSmRNA没有变化的情况下，胰岛 素能够促进IGFALS蛋白的合成。
而在肝脏中，细胞对GH排斥的增加也可以导致IGFALS合成的减少。
近期研究发现，在肝脏细胞中，大多数cAMP和细胞白介素对IGFALS合成的负调 控作用是通过对GH抵抗状态的感应产生的。在肝实质细胞中，cAMP对IGFALS 蛋白的表达主要表现在蛋白质水平上的调节，胞内cAMP的增加对IGFALSmRNA 水平的影响很微弱，也不会降低IGFALSmRNA的稳定性，但对IGFALS蛋白分泌 具有明显的抑制作用，并且这种抑制效应具有剂量依赖性。当加入GH时，cAMP 对!GiAZS*mRNA水平和IGFALS蛋白分泌均有明显的抑制作用。
5结语与展望 作为IGFs系统的组成部分，IGFALS的功能被长期忽视。但是，在过 去的几年中，越来越多的证据表明IGFALS在IGF-1和IGF-2的功能发挥着中扮演 着重要的角色，IGFALS基因和蛋白水平的异常均有可能导致动物体生长发育迟 缓等表型缺陷。因此，有关IGFALS的研究也愈来愈受到重视并取得了进步，其 中包括越来越多物种的IGFALS基因被克隆和定位；
IGFALS基因和蛋白质中重要 的结构被进一步明确，其生物学功能也被拓展；
而IGFALS蛋白合成的调节机制 也被初步探明。最近几年，有关IGFALS的研究主要集中在人类IGFALS基因突变 所产生的一系列临床症状和对人体内分泌以及新陈代谢的影响。如Heath等发现 IGFALS基因纯合突变会导致动物在出生后出现中度的生长缺陷和发育迟缓；
血液中IGF-1/2和IGFBP-3的含量非常低，而胰岛素含量过多。Dome沾等又发现具 有先天IGFALS缺乏症的患者都表现出一定程度的胰岛素抗性，但其病理学机制 还不明确。Kennedy等在敲除IGFALS基因的小鼠上尝试用GH和IGF-1进行激素治 疗IGFALS缺乏症等等。
综上所述，IGFALS功能及其作用机制的深入研究将有助于人们理解 IGFs信号系统调节哺乳动物生长发育的机理，从而为一些生长代谢异常相关疾病 的治疗提供理论基础。