幽门螺杆菌粘附素基因alpA的克隆与高效表达
幽门螺杆菌粘附素基因alpA的克隆与高效表达 【关键词】 ,螺杆菌 关键词: 螺杆菌，幽门;粘附素alpA;克隆，分子;基因表达 摘 要:目的 克隆并表达幽门螺杆菌粘附素AlpA基因. 方法 提取幽 门螺杆菌染色体基因，用PCR方法扩增alpA基因，将其克隆至表达载体 pET-22b(+)，转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达. 结果 分离得到了1.5kb 的alpA基因片段，并在大肠杆菌中实现了该基因的高效表达，在37℃诱导表达3h 后，表达产物占细菌总蛋白的31.9%.表达以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在， 其中主要是包涵体的形式，目的蛋白占不溶性蛋白的64.8%. 结论 幽门螺杆菌 alpA基因的克隆与表达为Hp疫苗的研制打下了基础. Keywords:helicobacter pylori;adhesion alpA;cloning mole-cular;gene expression Abstract:AIM To isolate and expresse alpA gene from He-licobacter pylori.METHODS The alpA gene was amplified from H.pylori chromosomal by PCR and inserted into the prokaryotie expression vector pET-22b(+).The recombinant plasmid was transformed into the BL21(DE3)E.coli strain.RESULTS 1.5kb alpA gene was successfully isolated.Re-combinant E.coli strains expressed AlpA were obtained， the expression protein amounted to31.9%of the total bacterial protein after induced with IPTG for3h at37℃.CONCLU┐SION Cloning and high-expression of alpA gene lay the foundation for the development of the H.pylori vaccine. 0 引言 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)已被确认是慢性胃病(包括胃炎和 消化性溃疡)的主要病原因子，同时与胃腺癌、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤的发 生亦密切相关[1-6] .目前根除Hp的主要手段是抗菌疗法，但有相当的局限性.疫苗 接种最有效，在Hp疫苗的研制中，获得了不同程度的保护作用，但仍不理想.如 从粘附素出发寻找保护性抗原从而阻断Hp对于胃粘膜的粘附，使之在胃蠕动时 随食物一起被排空，也许是一种有益的尝试.AlpA是已被证实的Hp粘附素中的一 种[7] ，目前国内尚未见有关的研究报道.我们对粘附素AlpA的基因进行了克隆 和表达，为构建Hp基因工程疫苗打下了基础. 1 材料和方法1.1 材料 菌株BL21(DE3)、质粒pET-22b(+)和幽门螺杆菌SS1为本所 保存.限制性内切酶NotⅠ，NocⅠ及T4DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶购自New England Biolabs公司，Taq DNA聚合酶、DNA相对分子质量标准λDNA/EcoRⅠ +HindⅢ购自华美生物工程公司，琼脂糖、dNTPs、DNA快速纯化试剂盒购自 Promega公司，测序质粒纯化试剂盒购自德国Qiagen公司，其他试剂为国产分析 纯. 1.2 方法 从固体培养基上刮取生长良好的Hp菌落，按基因组DNA小 量制备法提取Hp染色体DNA.质粒的快速抽提及大量制备均采用碱变性法.根据 文献[8]
设计引物，在其5’端加上合适的限制性酶切位点，由博亚公司合成.序列 如下:AlpA1:5’-TG G CC ATG GAT TGC GCT AGC ATA AGT TA-3’NocⅠ AlpA2:5’-AG T GC GGC CGC GAA TGA ATA CCC ATA AGA-3’NotⅠ热启动法 进行PCR，95℃变性30s，55℃退火50s，72℃延伸90s，35个循环后再延伸 10min.8g・L-1 琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果.质粒和目的基因DNA经NotⅠ和 NocⅠ双酶切，玻璃奶回收酶切片段，T4连接酶作用下16℃连接12h，转化宿主 菌BL21(DE3).重组转化子经筛选和鉴定后，采用373A DNA自动分析仪进行全自 动测序.AlpA阳性克隆经IPTG诱导表达后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析.外周质 部分表达产物:4℃，12000g离心1min，收集IPTG诱导培养物.将细菌沉淀重悬于 30mmol・L-1 Tris-CL(pH8.0)～1mmol・L-1 ～ED-TA-200g・L-1 蔗糖中，冰浴 10min，以12000g离心10min，上清即为外周质部分.胞内可溶性和包涵体部分:同 上法收集IPTG诱导培养物菌体.弃上清，菌体沉淀重悬于1/10体积的PBS中，在冰 浴条件下超声破碎至溶液较清亮，以12000g于4℃离心15min，上清即为胞内可溶 性部分，沉淀为包涵体部分. 2 结果 2.1 粘附素AlpA基因片段的序列 粘附素AlpA基因PCR扩增结果电泳 分析发现在1500bp左右有一条带，大小与预计相符(Fig1).将PCR产物经NotⅠ和 NocⅠ双酶切后，定向插入经同样双酶切的pET-22b(+)载体中，获得重组质粒命 名为pET-22b(+)/AlpA(Fig1).重组质粒经NotⅠ和NocⅠ双酶切后电泳初步鉴定结 果与预期相符.直接以重组质粒pET-22b(+)/AlpA为模板进行测序，得到了克隆片 段的DNA序列，与Odenbreit等[6] 报道的几乎一致，同源性高达97.3%. 2.2 粘附素AlpA基因在大肠杆菌中的表达 将粘附素AlpA阳性克隆 株在LB培养液(含100mg・L-1 氨苄青霉素)中37℃过夜培养，然后按1%转接至含 氨苄青霉素的LB培养液中，继续培养至A值为0.6～0.8，加IPTG至终浓度为0.1mmol・L-1 ，诱导表达3h，离心收集菌体，取其周质的渗透休克液、菌体超 声后的上清以及沉淀进行100g・L-1 SDS-PAGE电泳分析(Fig2).结果发现，经诱 导后表达Mr 为56500的蛋白，与预期一致，凝胶自动扫描分 析，其粘附素AlpA 重组蛋白占菌体总蛋白的31.9%，其中可溶性表达占上清的23.7%，包涵体占沉 淀的64.8%. 图1 - 图2 略 3 讨论 在当前以尿素酶B亚单位为主的多种候选抗原预防幽门螺杆菌感染 效果不确定的情况下[9] ，提示我们需发现新的保护性抗原.有关文献表明[10] ， 外膜蛋白(OMP)和膜孔素也许是
优秀的疫苗候选成分，而AlpA正符合上述要求: ①AlpA与Hp外膜蛋白膜孔素家族的HopC的同源性高达97.2%;②体外粘附实验 表明AlpA位于细菌表面.此外，AlpA作为基因工程疫苗的候选抗原还具有下列优 点:①位于细菌表面从而为免疫反应提供靶位;②作为粘附素为Hp致病所必须，具 有较高的保守性，而保守抗原通常为疫苗构建的首选抗原;③尽管是Hp致病的必 须成分，但本身无毒性且与人组织抗原无交叉反应;④因其成分为蛋白质，从而 能够通过构建基因工程疫苗实现大规模生产和纯化.这些优点符合Har-ry等[11] 在1998年提出的Hp疫苗抗原的标准. 我们在设计引物时去掉了AlpA信号肽序列，为便于下一步的表达和 纯化，又将其装入了带有组氨酸尾巴的融合表达载体.PCR、酶切鉴定和测序结 果显示获得了特异的Hp的alpA基因，蛋白电泳分析表明获得了高效表达Hp AlpA 的克隆株，为进一步研究其粘附机制和免疫保护作用奠定了重要的基础.