便秘大鼠肠壁内一氧化氮合酶表达和肠嗜铬细胞
便秘大鼠肠壁内一氧化氮合酶表达和肠嗜铬细胞 【摘要】 目的 观察便秘模型大鼠回肠和结肠一氧化氮合酶和肠嗜铬细胞 的变化及自然恢复情况，了解大黄所致便秘的可恢复性。方法 wistar大鼠60只， 按照完全随机的方法分为便秘组、恢复组、对照组，便秘组和恢复组给予大黄建 立便秘大鼠模型，恢复组于建立模型完成后任其自然恢复6周。以放射免疫方法 和免疫组织化学方法测定比较各组大鼠回肠和结肠一氧化氮合酶和肠嗜铬细胞 的变化。结果 便秘组和恢复组大鼠的回肠、结肠nos含量均明显升高（p0.05）, 恢复组回肠nos含量明显低于便秘组（p0.05），恢复组结肠nos含量与便秘组比较 无差别（p0.05）。便秘组大鼠肠道5-ht免疫反应阳性的肠嗜铬细胞密度高于对照 组，(回肠、横结肠p0.05)。恢复组大鼠肠道5-ht免疫反应阳性的肠嗜铬细胞密度 低于便秘组(回肠、横结肠p0.05)但高于对照组 (回肠、横结肠p0.05)。结论 长期 应用大黄等蒽醌类泻剂对肠道神经系统有明显的损害作用，回肠和结肠nos含量 和肠嗜铬细胞密度升高，停用大黄恢复性饲养6周后肠道神经递质部分恢复。【关键词】 一氧化氮合酶;肠嗜铬细胞;便秘;结肠 alteration and recovery of nitricoxide synthase and enterochromaffin cell expression in the intestinal wall of constipation model rats zhao shipeng, gui lin, bian honglei, et al. department of coloproctology, the third hospital of hebei medical university, research center of coloproctology in hebei province 050051, china ［abstract］ objective this study was designed to evaluate the changes of nitricoxide synthase (nos) and enterochromaffin cell (ec) in the ileum and colon of constipated wister rats and to observe the possibility of natural recovery. methods sixty healthy wister rats were divided randomly into control group, constipation group and recovery group. in constipation group and recovery group, the rats were administered leachate of rhubarb to make constipation model. the recovery group was recovered naturally for six weeks. nos and ec in the ileum and colon were detected by the method of immunohistochemical stain and radioimmunoassay and compared in the three groups. results nos expression in the constipation group and recovery group were significantly higher than that in the control group both in the ileum and in the colon (p0.05). compared with constipation group, the nos expression in the recovery group was decreased in the ileum (p0.05) and had no alternation in the colon (p0.05). compared with control group, enterochromaffin cell density in the constipation group and recovery group was increased both in the ileum and colon (p0.05). enterochromaffin cell density in the recovery group is lower than that in the constipation group both in the ileum and colon(p0.05). conclusion long-term administeration of rhubarb can do harm to the enteric nervous system through changing nos and ec. six weeks after stopping the administeration of rhubarb, nos expression and ec density partly recover.［key words］ nitricoxide synthase (nos);
enterochromaffin cell (ec);
constipation;
colon 慢传输型便秘（slow transit constipation， stc）是临床上常见的一类以结 肠动力减弱为主要特点的顽固性便秘。WWw.133229.CoM其病因、发病机制、 药物治疗机制尚未完全清楚。张连阳等应用大黄成功建立慢传输型便秘大鼠模型， 为研究泻剂对胃肠道的影响提供了可靠工具。
肠神经系统损伤与慢传输型便秘的关系密切，本研究课题在大鼠泻剂结肠 模型建立后，进行恢复性饲养，通过观察便秘大鼠回肠和横结肠一氧化氮合酶 （nos）和肠嗜铬细胞的变化和停用泻剂后的恢复情况，了解肠神经系统损伤后 的可逆转性。
1 材料与方法 1.1 动物分组 健康wistar大鼠60只，雌性，体重(200±30)g，由河北省动物 实验中心提供（合格证编号：dk0510071），按照完全随机的方法分为便秘组、 恢复组和对照组，各20只，分组后各组间体质量、性别无显著性差异。
1.2 动物处理 大鼠分笼饲养，保持适宜的环境(温度16～25℃；
相对湿度 50%～70%，清洁安静)。饲以普通级颗粒饲料，由河北省动物实验中心配制（合 格证编号：wk0510024）。饲养一周后开始建立模型，便秘组及恢复组采用大黄 浸液灌胃，每日1次，大黄浸液提取方法：大黄生粉加15倍沸水，恒温浸泡30 min 后过滤，灌胃前加温到30℃。首日剂量为800 mg/kg(生粉)，此后每日剂量增加200 mg/kg(生粉)，直至出现半数大鼠粪便变稀，保持剂量至80%的稀便消失,继续加 量给药，至又有半数大鼠粪便变稀，如此程序循环3次，待实验组第三次80%的 稀便消失1周后，采用活性炭灌胃法测定首粒黑便排出时间：大鼠禁食24 h，经 口灌入100 g/l活性炭悬液2 ml，从活性炭灌胃完毕开始记时，记录从灌胃到首粒 黑便排出的时间，证实首粒黑便排出时间显著延长，肠道传输速度明显减慢，停 止建模，便秘组继续饲养一周后与对照组同时取材，恢复组以同等体积蒸馏水灌 胃恢复喂养，时间为６周。饲养过程中对照组大鼠１只死亡，恢复组死亡２只， 具体原因不明。
1.3 取材及标本处理 乙醚麻醉，通过腹部正中切口暴露腹腔，迅速切取 距回盲瓣5 cm处回肠及横结肠组织,长约2 cm，生理盐水冲去肠内容物以及黏膜 表面粘附的粪便、分泌物及血液，部分组织多聚甲醛固定，石腊包埋。将包埋好的组织块连续切片，厚度为5 μm，分别裱于载玻片上，37℃温箱内干燥24 h，进 行免疫组织化学染色。部分组织加入0.9%生理盐水中煮沸10 min，冷却后置入电 动匀浆器中,加入1 mol/l乙酸后, 充分匀浆。将匀浆液转入塑料试管中,过夜,加入 等体积的1 mol/l氢氧化钠溶液,按3000 r/min离心15 min,取上清液,-20℃保存。用 放射免疫法测定nos含量。
1.4 免疫组织化学染色 1.4.1 试剂 兔抗5羟色胺（5-ht）抗血清原液、辣根过氧化物酶标记的链霉 素卵白素和生物素标记的山羊抗兔igg均购自北京中杉公司，抗体工作浓度均为 1∶100。
1.4.2 免疫组织化学染色 采用sp法,肿瘤组织石蜡切片使用leica rm 2255 切片机，切片厚5 μm，常规脱蜡至水；
抗原热修复，3％h2o2室温孵育10 min， 以消除内源性过氧化物酶活性，蒸馏水洗5 min3次，0.1%胰蛋白酶消化，37℃温 箱，20 min。浸入pbs 5 min 3次，滴加一抗，4℃冰箱内过夜；
pbs洗3次，每次5 min， 滴加二抗，37℃温箱，30 min，dab显色，自来水冲洗5次，苏木精复染1 min，水 洗，脱水透明封固。先在低倍镜下对组织切片全面观察,随后于200倍光镜下,随机 观察10个视野,计数每个视野阳性细胞数。
1.5 统计学处理 所有数据以mean±s表示，应用sas 6.12统计学软件进行 anova方差分析，p0.05差异有统计学意义。
2 结 果 2.1 便秘大鼠回肠和结肠nos含量 用放射免疫法测定nos含量，与对照组相 比，便秘组和恢复组大鼠的回肠、结肠nos含量均明显升高（分别p0.05）,恢复组 回肠nos含量明显低于便秘组（p0.05）,但恢复组结肠nos含量与便秘组比较无明 显变化(p0.05)(表1)。表1 各组大鼠回肠和横结肠nos(x±s)含量和每高倍镜视野 (200倍)肠嗜铬细胞数比较（略） 注：*与对照组比较p0.05；
#与便秘组比较p0.05 2.2 肠嗜铬细胞染色 便秘组、恢复组及对照组大鼠回肠、横结肠切片的 黏膜层均可见5羟色胺（5-ht）免疫反应阳性的肠嗜铬细胞，胞质和胞突中有棕色 或棕黑色颗粒，核蓝色,背景淡黄色，对比鲜明，肠嗜铬细胞形态多样，呈锥体 形、梭形、圆形、椭圆形、杆形等，胞突长短不一,部分细胞发出突起伸向腺腔 或黏膜固有层。便秘组大鼠肠道5-ht免疫反应阳性的肠嗜铬细胞密度高于对照组，(回肠、横结肠p0.05)。恢复组大鼠肠道5-ht免疫反应阳性的肠嗜铬细胞密度低于 便秘组(回肠、横结肠p0.05)但高于对照组 (回肠、横结肠p0.05)(表1) 。
3 讨 论 结肠慢传输性便秘是因结肠传输功能减弱致使肠内容物滞留于结肠而引 起的顽固性便秘，病因不清，部分患者可能是滥用泻剂所致。bassotti等［1］行 小肠测压证实，结肠慢传输性便秘患者的小肠存在异常动力模式，包括强烈的不 协调收缩和散发性束状收缩，但作用机制尚不清楚。其它研究也发现，部分结肠 慢传输性便秘患者存在全胃肠道动力异常，如胆囊、胃排空及小肠转运功能减慢, 肠神经系统异常与慢传输型便秘有关［2］。
一氧化氮(nitric oxide，no)是一种气体信使分子，具有独特的理化性质和 生物学活性。许多研究结果确认no是胃肠道nanc神经所释放的主要抑制性递质， 抑制胃肠运动。一氧化氮合酶(nos)是内源性no产生的关键酶， nos广泛存在于从 食管到肛门内括约肌的胃肠道组织内，说明no在调节胃肠运动中的重要性。离体 实验中，观察到大鼠小肠和横结肠蠕动反射中的下行抑制成分和食物进入豚鼠胃 内引起的胃底舒张和胃容积增大，是由nanc神经释放的no介导。目前对no的病理 生理作用还不太清楚，但可以推测，产生no的神经密度、no释放过程、或平滑肌 对内源性no的敏感性发生变化时，都可以使神经肌肉的功能异常，使正常的兴奋 性和抑制性神经活动失去平衡，有效的推进性运动减少，从而导致胃肠道运动异 常。
本实验结果显示恢复组和便秘组回肠及结肠肠壁组织nos含量较对照组明 显增高（分别p0.05），恢复组回肠nos含量明显低于便秘组（p0.05）,但恢复组 结肠nos含量较便秘组降低，但差别无统计学意义。表明长期应用大黄等蒽醌类 泻剂对肠道神经系统有明显的损害作用，或者是扰乱了肠道神经递质分泌的平衡 状态，引起胃肠道no的产生增多，但这种损害作用是可逆的，停用泻剂后回肠肠 壁nos恢复性下降较快，但结肠肠壁神经系统的恢复较慢，能否在较长时间内恢 复正常状态有待进一步研究。
肠嗜铬细胞(ec)存在于胃肠道黏膜层，合成并储存机体大部分5-ht，肠嗜 铬细胞释放的5-ht通过与相关受体结合，调控胃肠道感觉、分泌及运动功能。具 体作用方式有以下三种：①直接作用于上皮细胞或平滑肌产生分泌及运动②作用 于内源性传入神经（ipans）及中间神经元，产生并调节分泌、蠕动反射：肠嗜铬 细胞释放的5-ht通过5-ht1p受体激活黏膜下ipans，黏膜下ipans在释放乙酰胆碱(ach)的同时释放降钙素基因相关肽［3］，进而通过不同的神经递质如vip、no等 兴奋或抑制胃肠道运动及分泌。③作用于外源性传入神经突触后膜上的5-ht3 受 体，将感觉信号传入中枢神经系统［4］。其中肠嗜铬细胞释放的5-ht是胃肠道运 动及分泌的始动因素。肠嗜铬细胞在肠易激综合征患者的肠道黏膜中有改变并参 与了内脏感觉过敏的发生［5,6］，但在大黄所致便秘中的作用却未见报道。
本研究在实验中发现，对照组大鼠肠道所有切片的黏膜层中均可见5-ht免 疫反应阳性的肠嗜铬细胞，胞质和胞突中有棕色或棕黑色颗粒，核呈蓝色,背景 呈淡黄色，对比鲜明。便秘组大鼠回肠、横结肠5-ht免疫反应阳性的肠嗜铬细胞 密度高于对照组(p0.05)。恢复组大鼠回肠、横结肠5-ht免疫反应阳性的肠嗜铬细 胞密度低于便秘组(p0.05)，但高于对照组 (p0.05)。分析其原因可能如下：在建 模阶段，逐渐增加的大黄破坏了肠嗜铬细胞的释放平衡，导致大量5-ht进入腺腔 和黏膜固有层，促进了胃肠道运动而产生腹泻，此时肠嗜铬细胞内5-ht含量减少， 随着大黄改为维持剂量，肠嗜铬细胞逐渐耐受刺激，5-ht释放减少，合成及重摄 取增多，细胞内5-ht含量增加，颗粒增多，较多细胞能被检出。与此同时，黏膜 下丛ipans、平滑肌以及分泌细胞在前阶段超量5-ht作用下，出现受体脱敏，对5-ht 效应性下降，致使肠道运动减弱，分泌减少，稀便消失。药物继续加量时，再次 破坏了5-ht的释放平衡，形成上述循环。上述原因造成建模后肠嗜铬细胞对大黄 刺激出现耐受，5-ht释放减少，不足以维持胃肠道正常运动及分泌，此时免疫反 应阳性的肠嗜铬细胞密度升高，恢复期大鼠在停药后肠嗜铬细胞的耐受性逐渐恢 复，5-ht释放增加，肠嗜铬细胞内5-ht含量减少，有些细胞未能用免疫组化方法 检出,检出的细胞着色浅淡,5-ht免疫反应阳性的肠嗜铬细胞密度降低。
大黄所致便秘大鼠肠壁组织肠嗜铬细胞及nos的变化如何影响小肠的功能， 目前研究较少。本试验仅研究了泻剂致大鼠便秘后肠嗜铬细胞和nos的变化及其 在造模后6周的恢复情况，对于泻剂致便秘的整个病理过程及胃肠道其它神经递 质的变化有待深入研究。