他拉达非对肺动脉高压模型大鼠降钙素基因相关
他拉达非对肺动脉高压模型大鼠降钙素基因相关 肺动脉高压（PAH)是以平滑肌细胞增生、肺血管收缩及重构 为特征 的疾病，能引起患者右心室肥厚、肺血管阻力增加最终导 致患者右心衰竭和死 亡。近年的研究显示，血管重构是PAH发生 和发展的重要病理生理机制，肺动 脉平滑肌细胞的过度增殖与迁 移是引起血管重构的关键因素[1]。降钙素基因相 关肽（CGRP)是 感觉神经的重要递质，是目前已知最强的舒血管物质，在调节 血 管阻力和维持血压稳定等方面有重要作用[2],而p27及ERK1 /2 参与的信号通 路在调节血管平滑肌细胞增殖及血管重构方面亦 有重要作用。他达拉非为5型磷 酸二酯酶(PDE5)抑制剂，广泛应 用于治疗肺动脉高压，但其作用机制尚未完全 明了。本研究中基 于CGRP具有降压及抑制血管重构的作用，探讨了 CGRP及 ERK1 /2/p27在他达拉非降低肺动脉高压、预防缓解肺血管重构 中的作用，现报 道如下。1 材料与方法 1.1 仪器、试药与动物仪器:Model680型酶标仪（美国Bio-Rad公司）；
光 学显微镜 (曰本Olympus公司）；
BL-410型多功能生理记录仪（成都泰盟 科技有 限公司）;Mini PROTEAN电泳系统（美国Bio - Rad公司）。
试药：盐酸他达拉非片（美国Elilillyand公司，国药准字 H20120472， 规格为每片20 mg),药片粉碎后溶于10 mL生理 盐水备用；
野百合碱（MCT, Sigma 公司，批号为063K1183),溶于1 mol/L稀HCl溶液，制成1%浓度溶液,调pH至7. 2, 加生理盐 水配制成10 g/L MCT溶液。兔抗鼠CGRP多克隆抗体(美国Sigma 公 司）；
小鼠抗大鼠p27单克隆抗体、小鼠抗大鼠ERK1 /2单克隆 抗体、小鼠抗大 鼠p- ERK1 /2单克隆抗体、小鼠抗大鼠GADPH 单克隆抗体(美国Santa Cruz公司）。
动物:36只健康雄性SD大鼠,SPF级,体重180〜200 g,由南 方医科大学 动物实验中心提供,许可证号SCXK(粵)2011 -0015。
动物饲养及所有操作流程均 遵守《实验动物管理条例》,可自由进 食及饮水。1.2 方法动物模型建立：适应性饲养5 d后，将36只雄性SD大鼠随 机 分为3组，每组12只，A组为MCT诱导肺动脉高压（PAH)组， B组为他达拉非组， C组为对照组。A组、B组大鼠给予皮下注射 已配制好的MCT溶液60 mg/kg, C组 给予腹部注射相应剂量生 理盐水，相同条件下喂养，自由饮食、饮水。4周后， 动物模型经胸 体彩超鉴定后,B组大鼠给予0. 5 mg/(kg • d)他达拉非溶液灌胃 处 理，A组、C组给予相同剂量生理盐水灌胃处理,相同条件饲养 4周后，取材进行 相关检测。
血流动力学及右心室肥厚病变分析：试验中大鼠水合氯醛腹 腔麻醉 后将右心导管预充肝素盐水后与压力换能器相连，用 20号套管针经右心室穿刺 至肺动脉主干记录肺动脉收缩压(PASP)及平均肺动脉压(mPAP);处死大鼠,结扎 主动脉,取心、肺， 经生理盐水漂洗后结扎肺动脉，分离心脏，秤取游离右室壁 和左 室+室间隔质量（RV, LV + S),计算右心肥厚指数RV/(LV + S)。
肺血管形态学观察：石蜡包埋固定并切片，将切片经HE染 色后置于 显微镜下观察，随机选取直径50〜150 ^m肺小动脉标 本，用图像分析技术计算 肺血管内外管径均值，管壁厚度（WT), 膜厚度占管腔比例（WT, % ) =2 xWT/ED, 管壁横截面面积占管 腔面积的比例(WA, % ) = (TA- IA) /TA。
Western Blot法分析CGRP, p27及ERK1 /2表达水平：在液 氮中将肺动 脉研磨成粉末加200 ^L裂解液(50 mmol/LTris - HCl pH = 8. 0,150 mmol /L PMSF, 0. 1% NP - 40,蛋白酶抑制剂）。4 °C 12 000 r / min离心15 min,取上清，米用 Bradford法检测蛋白浓 度；
取上述制备的蛋白样品50 ^g上样到15%SDS-PAGE 凝胶， 电泳完毕后将蛋白电转至NC膜，用5%脱脂奶粉封闭，分别加一 抗,37 V 孵育2 h,经0. 1%TBST漂洗后加二抗（1 : 2 000)室温孵 育2 h,TBST洗膜后加ECL, X线胶片定影，扫描后用IPP 6.0进 行图像分析。
1.3 统计学处理采用SPSS 19.0进行统计学分析。计量资料以X±s表示， 行t检验;计数资料行f检验。P 0. 05为差异有统计学意义。2 结果 结果见表1和表2,图1和图2。
氧、炎症及药物刺激能使肺血管内皮细胞结构、功能及代谢发生 紊 乱，启动PAH的发生 。血管内皮损伤破坏了其屏障作用，干 扰了平滑肌细胞与 内皮细胞间的内皮-肌连接作用，促进肺血管 平滑细胞过度增殖，引发肺血管重 构 。而在肺血管重构的过程 中细胞周期调控相关因子在其中发挥重要的作 用,27作为细胞 周期蛋白依赖性激酶（CDK)的负调节因子，能通过抑制cyclin/ CDK复合物的磷酸化，降低其活性，阻止细胞过度增殖。动物试验 研究 显示， 激活ERK1 /2信号通路可促进p27的降解，导致细 胞进入细胞增殖周期。(Qin等 的研究结果显示，在肺动脉平滑肌 及细胞中CGRP能显著抑制血管紧张素n的表 达，而ERK1 /2在 此过程中被激活。
目前,PAH治疗的选择一般包括药物治疗、介入及外科治疗， 其中药 物治疗包括钙离子拮抗剂、内皮素受体拮抗剂等肺动脉血 管扩张剂，通过阻断 肺动脉高压发病的不同环节起作用，取得了 较好的疗效。但介入及外科治疗， 包括肺移植、心肺联合移植及经 皮球囊房间隔造口术，手术风险大，术后并发 症多[8]。他达拉非为 新型长效、具有选择性的磷酸二酯酶抑制剂，具有较好的 耐受性， 能长时间扩张血管，提高运动耐量，降低恶化发生率，可显著改善 患 者的生活质量[9]。
本研究中，采用野百合碱建模，且后期对大鼠血流动力学变 化及右 心肥厚指标分析，结果显示PAH模型组RVSP及mPAP显 著增高，他拉达非干预 后下降但仍高于对照组，提示采用野百合 碱造模成功。RV / (LV + S)在模型组 和干预组无显著性差异,但均 显著高于对照组，提示造模过程大鼠已经出现右心 结构异常。光 镜下模型组肺动脉血管内皮细胞重症脱落，管腔不规则增厚，狭 窄 甚至闭塞，管腔内残留大量红细胞，肺泡腔内见大量炎性细胞 浸润撒及WT%结 果提示，经他拉达非干预后，肺小血管重构 得到改善。Western Blot法分析结果 证实，A组CGRP, p27显著降 低，而p - ERK1 /2表达显著升高，与Zhang等[1。]的研究结果一 致,内源性CGRP的消耗能加重PAH血管重构，其作用机制可能 与 抑制ERK1 /2磷酸化，进而上调p27的表达有关。
综上所述，他拉达非能显著改善PAH模型大鼠的血管重构，CGRP、 27及ERK1 /2在其中可能具有重要作用。