谈福建金线莲提取物对CCl4所致小鼠急慢性肝损伤的保护作用
谈福建金线莲提取物对CCl4所致小鼠急慢性肝损伤的保护作 用 病毒性、药源性、酒精性肝炎在人群中发病率很高, 这些肝炎均存在程度 不一的肝损伤和肝纤维化(hepatic fibrsis, HF), 肝纤维化是慢性肝炎发展到早期 肝硬化的必经阶段。研究发现, 肝纤维化甚至早期肝硬化都是可以逆转的, 因此 促进了保肝药和抗肝纤维化药物的研究开发。金线莲(HerbaAnoectoch ili )为兰科 开唇兰属植物花叶开唇兰的全草, 在民间素有药王、神草、乌人参等美称,其性甘、 平, 具有清热凉血、固肾平肝、祛风利湿等功效。其野生资源稀少, 是一味名贵 珍稀的中草药。近年来, 组培技术的研制和发展, 解决了金线莲的药源稀缺, 大 大促进了金线莲的研究开发。据报道, 台湾金线莲(A. formosanus )和高雄金线莲 (A. koshunensis )具有肝障凝之保肝作用, 而福建金线莲(A. roxburghii )肝保护作 用研究尚未见报道。本实验拟对福建金线莲进行初步提取, 观察其对肝损伤的保 护及肝纤维化的防治作用, 为金线莲在肝病防治方面的临床应用提供参考。1 材料 1. 1 药物与试剂 金线莲鲜草[ Anoectoch ilusroxburgh ii (W al.l ) lind.l ] (产于福建省福州市 闽侯县白沙镇, 中国科学院植物研究所郎楷永研究员和福建师大生物系林来官 教授鉴定, 福州佳乐达生物工程有限公司);益肝灵片(含水飞蓟素38. 5mg /片, 上 海汉殷药业有限公司, 批号040302);ALT、AST生化测定试剂盒(中生北控生物科 技股份有限公司);CC l4 为分析纯;其他试剂均为国产分析纯。
1. 2 仪器与动物 AV2700全自动生化分析仪(日本M ishima OLYMPUS 公司);LABOROTA 4001低温真空浓缩仪(德国He ido lph Instrument公司)。清洁级ICR小鼠, ♀♂各半, 体重18 ～ 22g[福建医科大学动物实验中心, 动物合格证 号:SCXK(闽)2004-0002] 。
2 方法 2. 1 金线莲提取液的制备(1)水煎液 金线莲新鲜全草, 加蒸馏水, 煎煮3次, 滤过, 合并滤液浓缩成 膏状。
(2)醇提液 取金线莲新鲜全草, 置真空干燥机中以60℃干燥, 加入95%乙 醇适量, 80℃水浴回流3次, 滤过, 合并滤液浓缩成膏状。
(3)全草榨汁液 取金线莲新鲜全草, 洗净榨汁, 迅速以低温真空浓缩。
2. 2 金线莲提取液对小鼠急性肝损伤的影响 采用小鼠ip 0. 1%CC l4 的蓖麻油溶液制作急性肝损伤模型。小鼠随机分 成9 组, 每组20 只, 分别为正常组、模型组、益肝灵组、水提低、高剂量组、醇 提低、高剂量组, 榨汁低剂量、高剂量组。ig给药, qd, 连续3d。益肝灵组用益肝 灵片制成悬液, 按水飞蓟素含量以0. 5g kg -1体重的剂量给小鼠ig。非给药组ig生 理氯化钠溶液。于末次给药后2h, 除正常组外,其余各组小鼠ip 0. 1%CC l4 油溶 液(10 m l kg -1体重), 正常组ip等体积蓖麻油。禁食不禁水, 24h后全部小鼠摘眼球 取血, 离心, 取上层血清测ALT、AST。采血后, 迅速解剖, 取出肝脏, 在同一肝 小叶上取一小块肝组织放入10%甲醛溶液固定, 作HE染色, 光镜下观察其病理 组织学变化。
2. 3 金线莲提取液 对小鼠慢性肝损伤及早期肝纤维化的影响 以苯巴比妥钠溶液(350mg L-1 )为饮用水饲养小鼠2周, 诱导肝药酶;第3周给小鼠ig 50%CC l4的蓖麻油溶液 (20m l kg-1体重), 1次/5d, 连续5周, 制作慢性肝损伤模型。小鼠随机分成4组, 每 组20只, 分别为正常组、模型组、高、低剂量金线莲榨汁组。模型组和给药组ig 50%CC l4 的蓖麻油溶液, 正常组ig 等体积的蓖麻油。给予CC l4 的同时开始ig 给药, qd, 非给药组ig 生理氯化钠溶液。于末次给CC l4 24h后采血, 测血清ALT、 AST。解剖取肝、脾和胸腺称重。取肝组织作网状纤维染色检查。
2. 4 数据处理 采用SPSS 11. 1统计软件处理数据, 分析数据的组间差异。
3 结果 3. 1 金线莲提取物对小鼠急性肝损伤生化指标及肝组织学的影响3. 1. 1 金线莲提取物对急性肝损伤生化指标的影响 金线莲榨汁组小鼠血清中的ALT、AST水平分别低于模型组的30%和 45%(P 0. 01), 与益肝灵组无显著性差异, 接近正常组水平。此外, 金线莲的水煎、 醇提和榨汁组的ALT、AST值之间亦无显著性差异。提示金线莲3种不同提取液 在剂量为1. 0和5. 0g kg- 1时对CC l4 引起的小鼠血清转氨酶升高均具有抑制作 用。
3. 1. 2 金线莲提取物对急性肝损伤肝组织学的影响 CC l4 模型组中, 小鼠肝细胞排列紊乱, 伴有炎症细胞浸润, 并呈不同程 度的胞浆疏松、气球样变。金线莲各给药组和水飞蓟素组肝细胞大小较一致,其 肝细胞肿胀、坏死和炎症细胞浸润程度明显轻于模型组。
3. 2 金线莲榨汁液对慢性肝损伤小鼠生化指标、肝组织学及免疫器官形态 学的影响 3. 2. 1 金线莲榨汁液对慢性肝损伤小鼠肝生化指标的影响 金线莲组小鼠 血清中的ALT、AST水平分别低于模型组的45%和40% (P 0. 01), 接近正常组水平。
提示金线莲具有降低慢性肝损伤小鼠的血清转氨酶的作用。
3. 2. 2 金线莲榨汁液对慢性肝损伤小鼠肝组织学的影响 CC l4 模型组中, 小鼠肝细胞排列紊乱, 增生的纤维组织形成粗大的条索部分已经互相连接形成 间隔, 已形成肝硬化早期的特征。金线莲组的肝组织变化轻于模型组, 增生的纤 维组织形成小的条索但尚未互相连接形成间隔。
3. 2. 3 金线莲榨汁液对慢性肝损伤小鼠免疫器官形态学的影响 模型组的 肝/体重、脾/体重比值明显高于正常组(P 0. 01), 而胸腺/体 重比值低于正常组(P 0. 01), 提示反复给予CC l4 后小鼠的肝脾明显肿大, 而胸腺萎缩;高低剂量金线 莲组的肝/体重、脾/体重比值均明显低于模型组(P 0. 01), 而胸腺/体 重高于模型 组, 与正常组较为接近。另外, 解剖发现模型组小鼠的肝脏表面粗糙, 而金线莲 组小鼠的肝脏表面比较光滑。说明金线莲对CC l4 造成小鼠部分脏器的损伤具有 保护作用。
4 讨论 4. 1 CC l4 肝损伤的作用机制CC l4 进入体内经肝药酶P-450激活, 产生自由基, 与肝细胞生物膜上的 脂质起过氧化反应, 生成脂质过氧化物, 同时引起C a2 +的内流, 使细胞膜结构 和功能受到破坏, 导致肝细胞中ALT、AST 释放入血, 使血中ALT、AST 升高。
本实验表明, 金线莲提取物能明显降低小鼠CC l4 肝损伤模型的ALT、AST, 这 提示金线莲可能是通过清除自由基、稳定细胞膜而对肝细胞起到保护作用的。有 研究表明, 金线莲对于以CC l4 诱发的大鼠原代培养肝细胞的损伤有明显保护作 用。此外, 台湾学者[ 7]报道金线莲提取物能够对抗FeC l3-维生素C 导致的小鼠 肝脂质过氧化, 同时对黄嘌呤氧化酶所致的小鼠过氧化物和自由基都有较好的 清除作用。这与我们的实验结果相一致, 但金线莲肝保护作用的靶点和机制尚未 确定,还有待进一步研究。
4. 2 CC l4 慢性肝损伤并诱导早期肝纤维化是经典动物模型 单纯给予小鼠高浓度CC l4 , 形成肝纤维化的时间较久, 动物死亡率较高, 且肝纤维化的持续时间较短。在给CC l4 前2周, 先用苯巴比妥钠溶液作为饮用水 诱导小鼠肝药酶, 再给小鼠ig CC l4 , 使小鼠较快形成肝纤维化, 减少CC l4 用 量, 死亡率降低, 并且缩短造模时间, 肝纤维化的持续时间也较长。另外, ig给予 CC l4 与sc和吸入法比较, 其优点在于CC l4 可直接经门静脉到达肝, 1. 5h 肝内 即可达最高水平, 比较贴近临床病理过程。
4. 3 金线莲主要有效成分 为多糖近年来, 金线莲的药理活性日益受到关注, 对其化学成分的研究也 日渐兴起。据报道，已从金线莲中分离到一些新的化学成分, 其生物活性有待研 究。本实验采用水煎、醇提、榨汁3种方法制备金线莲粗提液。水煎法和榨汁法 可提取到多糖成分, 而在醇提液中不含或含较少多糖成分。实验结果显示这3种 提取液在对抗CC l4 所致的肝损伤方面的作用无明显差别。提示金线莲中保护肝 细胞的有效成分可能不只是多糖类成分。但对金线莲中有效成分的研究需要进一 步的分离纯化。
4. 4 目前抗肝纤维化 药物作用的环节主要有:抑制或减轻炎症反应;抑制肝星状细胞激活;促进 肝脏细胞再生;保护肝细胞阻止其凋亡;抑制或中和细胞因子活性;抑制细胞外基 质合成及分泌和增加瘢痕性基质降解。研究发现, 许多中药复方和有效成分有抗 实验性肝纤维化作用, 甘草甜素、氧化苦参碱等已试用于临床, 效果较为满意。这些中药有效成分大多有减轻肝脏炎症或促进肝细胞再生, 减少肝脏胶原沉积, 促进肝脏胶原降解等功能。目前认为, 金线莲的肝保护作用可能是通过清除自由 基、稳定细胞膜等环节。说明金线莲可通过抑制肝细胞受损, 从而延缓由此继发 肝纤维化的病理进程, 对临床上早期肝纤维化有一定的防治作用。本课题下一步 的工作将研究金线莲对肝纤维化各具体环节的作用。