草乌甲素在不同破损的皮肤的体外透过率研究
草乌甲素在不同破损的皮肤的体外透过率研究 经皮给药制剂又称经皮给药系统或称透皮治疗系统，是药物通过皮肤 吸收后转运至局部组织或全身血液循环而发生局部或全身作用的制剂[1].此类制 剂的安全性评价常因其剂型、给药途径等特殊性而有一定难度，主要因为经皮给 药后的实际剂量及毒性暴露量和毒性反应程度取决于透入皮肤的药量，而临床上 皮肤病变往往改变了正常皮肤屏障完整性和药物通透性，药物的透皮吸收率除了 受药物本身理化特性、给药方法等因素限制外，还常因皮肤屏障功能状态受到不 同程度的影响[2-3],因此，在刺激性和长期毒性试验中通常需将破损皮肤模型用 于试验，以充分暴露受试物的局部刺激性或/和全身毒性。目前，国内通常采用体外扩散池法、残留量分析法和在体微透析法等 方法进行经皮给药制剂的透过率或药动学方面的研究[4-5];安全性评价实验室常 用的破损皮肤制备方法有针头划伤、砂纸打磨、钝器刮伤或由脱毛剂造成的表皮 损伤[6].但动物破损皮肤与人临床不同疾病下皮肤的角质层状态并不完全一致， 并且实验操作者在选择上述制备方法时通常考虑的多是操作的方便程度，往往凭 经验以肉眼判断破损程度，忽视了脱毛过程所致角质层损失差异和皮肤破损模型 制备方法及其他因素对实际的病理损伤程度及药物透过率产生的影响，从而可能 对经皮给药制剂的毒性评价带来不同程度的干扰。
本文以草乌甲素凝胶膏为受试物，选用针头划伤、砂纸打磨、4%Na2S 脱毛剂处理这3种有代表性的皮肤破损方法制备家兔破损皮肤，以体外扩散池法 开展体外透皮实验，考察上述方式所得破损皮肤的体外吸收特征，并从破损皮肤 的组织病理学形态和药物皮肤体外渗透速率这两个方面探讨不同破损皮肤模型 制备方法及因素产生的差异及影响，为经皮给药制剂毒性暴露和安全性评价选择 更为科学合理的病理模型提供实用的技术方法。
1材料和方法 1.1仪器 Agilent1200SL液相色谱仪(Agilent,二元泵，自动进样 器);API3200Q-Trap三重四级杆串联质谱(美国AB公司);Analyst1.5工作站;智能透 皮试验仪(天津富兰斯YB-P6);分析天平(美国Ohaus公司);Allegra64R高速冷冻台 式离心机(美国Backman公司);XW-80A涡旋混合器(上海精科实业有限公 司);MD200氮吹仪(杭州奥盛仪器有限公司);宠物用电推剪(上海CODOSKP-3000);组织病理学检查仪器均为德国Leica公司。
1.2试药 草乌甲素凝胶膏(载药量约为0.06mg/cm,云南省药物研究所，批号 201307);草乌甲素对照品(质量分数≥98%,中国食品药品检定研究院，批号 100530-200501);次乌头碱(质量分数≥98%,北京世纪奥科生物技术有限公司，批号 MUST-13011706);甲醇(色谱纯，德国Merck公司);其余试剂均为分析纯。
1.3动物 普通级日本大耳白家兔6只，雌雄各半，3~4月龄，2.4~3.0kg,来源于 昆明市艾尼莫实验动物养殖中心，许可证号：SCXK(滇)K2012-0002. 1.4LC-MS/MS检测条件 1.4.1色谱条件色谱柱为AgilentponoshellSB-C18柱 (50mm×4.6mm,2.7μm);流动相为0.1%甲酸10mmol/L醋酸铵水溶液-甲醇(12∶88);
体积流量0.5mL/min;柱温20℃;进样量5μL. 1.4.2质谱条件ESI源，POS模式，MRM定量。
草乌甲素[M+H]+1[M+H]+为m/z616.3→556.2.质谱参数：
CUR10.0,IS5500.0,TEM300.00,GS125.00,GS235.00,iheON,CADLOW,DP72.0,EP10 .00. 1.5检测样本预处理 精密加入10μL内标工作液至2mLEP管中，氮吹至干，再精密移取 100μL经扩散池收取的PBS溶液，旋涡2min,加入1mL醋酸乙酯，涡旋 3min,4000r/min离心10min,取上清600μL,氮气吹干，200μL甲醇复溶，15000r/min 离心10min,取上清，5μL进样。
1.6离体破损皮肤制备 破损皮肤的破损程度参照2014年5月13日颁布的《药物刺激性、过敏 性和溶血性研究技术指导原则》的附录中有关“3.皮肤刺激性试验”对破损皮肤破 损程度的描述，即“破损皮肤试验中皮肤破损程度以损伤表皮层为限”[7],故本实 验中选择了3种有代表性的制备方法来获得破损皮肤，并结合组织病理学检查结果综合判断，确定皮肤的最适破损程度。
1.6.1破损方法家兔乙醚麻醉后，用宠物电推剪先将背部毛尽量剔除干 净，剔除过程中注意勿将兔皮肤划伤。将6只去毛后的家兔分为3个组，每组2只。
按下面3种方式制备破损皮肤。
A法：化学脱毛剂即将纱布浸于4%Na2S中，再将纱布敷于家兔皮肤 5min后取下，以洁净纱布擦净皮肤表面残余Na2S,再用大量清水冲洗至Na2S除净。
B法：针头划即用5mL一次性注射器针头在家兔皮肤表面间隔3mm划 多条横线，再间隔3mm划多条竖线，形成多个“井”字，深度以皮肤表面变浅红即 可。
C法：砂纸打磨即将砂纸包裹在木棒上，然后在家兔皮肤表面轻轻摩 擦，直至皮肤表面变为浅红。
1.6.2离体破损皮肤制备6只家兔分为3组，按上述3种方法破损皮肤后 及时颈总动脉放血安乐死，剖取上述3种方法制备的破损皮肤各约6×6cm2,除去皮 下组织和脂肪，以生理盐水冲洗适当时间，每种方法所获的每块破损皮肤均分为 两部分，其中一部分皮肤置福尔马林溶液中固定，用于组织病理学检查，以确定 皮肤破损程度是否适宜，另外一部分皮肤则用于体外透皮实验。
1.7破损皮肤病理学检查 病理取材厚度2~3mm,长度约1~2cm,切片厚度3μm,HE染色、制片，进 行组织病理学镜检，据镜检结果对各块破损皮肤所见病变程度进行半定量分级。
1.8家兔破损皮肤体外透皮试验 取草乌甲素凝胶膏，按扩散池接收口内径大小(1.17cm2)将凝胶膏剪 切，待用。将按“1.6”要求制备的离体破损皮肤固定于改良Franz扩散池上，皮内 层面向下(朝向扩散池内方)，皮外层面向上，将剪好的草乌甲素凝胶膏揭去保护 层，紧贴于皮肤外层，用夹子将扩散池组合夹紧固定。扩散池接收室事先放入磁 力搅拌子，并加满32℃的0.05mol/L、pH7.4PBS溶液作为接收介质(12mL)，排出 接收室中的气泡，使家兔皮肤内层与接收介质紧密接触，池外以32℃水浴保温， 磁力搅拌子以350r/min的速度搅拌，分别于1、2、3、4、5、6、7、8、10、11和 24h从接收池中抽取0.3mL的PBS接受液，同时向接收池中补充等量32℃的0.05mol/L、pH7.4的PBS溶液。将收集的PBS接收液置于2~8℃备存，待所有时间 点PBS接收液均收集后，分别按“1.5”项下方法处理、分析检测。
1.9数据处理 通过各时间点样品测定结果，计算每个时间点单位面积的累积释药量 (Q)，并对结果进行评价。
Q=(PnV+V0-=11niip)/A10为每次取样的体积，Pn为第n次所取样品测 定的药物浓度，pi为第i个样品的药物浓度测定值，A为扩散池中家兔皮肤的有效 扩散面积。
2结果 2.1特异性 在本实验LC-MS/MS检测条件下草乌甲素及内标次乌头碱峰形均良 好，在各自检测通道内未见干扰峰，两者保留时间分别为1.21min和1.19min。
2.2基质效应 本实验考察了空白PBS溶液经提取后，内源性杂质对草乌甲素和内标 次乌头碱的离子抑制情况。
结果显示，草乌甲素PBS溶液质控样品在1.987、31.80、509.0ng/mL 这3个质量浓度下的基质效应(n=6)分别为96.49%、94.92%、97.28%;内标次乌头 碱基质效应(n=18)为93.27%. 2.3标准曲线和线性范围 以草乌甲素PBS溶液质量浓度C(分别为0.1242、0.4967、1.987、7.950、 31.80、127.0、509.0ng/mL)为横坐标，草乌甲素峰面积(Ab)和内标峰面积(Ah)比 值为纵坐标Y,做线性回归，得回归方程为：Y=0.0189C-0.00257(r=0.9928)，权重 系数w=1/C2,药物浓度与峰面积间线性关系良好，线性范围为0.1242~509.0ng/mL, 最低定量限为0.1242ng/mL(S/N≥10)。
2.4精密度和准确度制备质量浓度分别为1.987、31.80、509.0ng/mL的草乌甲素PBS溶液 质控样品，按“1.5”项下操作，重复3d,据随行的标准曲线计算测定浓度，由实测 浓度计算批内与批间精密度，每批实测浓度的平均值与理论浓度的比值为准确度。
2.5回收率 制备质量浓度分别为1.987、31.80、509.0ng/mL的草乌甲素PBS溶液 质控样品，按“1.5”项下操作，测定得峰面积为A;精密移取100μL空白PBS溶液按 “2.2”项下操作提取后得到的含基质残渣，用浓度分别为1.987、31.80、509.0ng/mL 的草乌甲素工作液复溶，测定得峰面积B.A和B的百分比即为提取回收率。
2.6稳定性 制备浓度分别为1.987、31.80、509.0ng/mL的草乌甲素PBS溶液质控 样品，考察PBS溶液样品于32℃放置3d、2~8℃存放24h、于32℃放置3d后再于 2~8℃存放2d的稳定性;同时考察按“1.5”项下操作处理后样品在室温及2~8℃放置 3d内多个时间点的稳定性。以随行的标准曲线计算测定浓度与理论浓度比较，变 化范围在1.33%~11.89%,表明在上述条件下草乌甲素稳定性良好。
2.7破损皮肤病理检查结果 破损皮肤病理检查结果见图2,针头破损皮肤，基本完好;纱纸破损皮肤， 局部表皮缺失，真皮完好;4%Na2S破损皮肤，局部表皮缺失、真皮浅层缺失。
2.8破损皮肤体外透皮试验结果 将3种不同方式制备的破损皮肤在设定的时间点下取样测定，通过测 定值计算得到的单位面积释药量见表2,平均累积释药曲线见图3.以每种破损方式 下平均累积释药量Q对时间t进行动力学方程拟合，结果针头划伤破损方式的拟合 曲线为Q=96.82t-285.6(r2=0.9564)，渗透速率参数(Js)为96.82ng/(cm·h)、滞留时间 (Tlag)为2.95h;砂纸打磨破损方式的拟合曲线为Q=210.2t-759.9(r2=0.9679)，Js为 210.2ng/(cm·h)、Tlag为3.62h;4%Na2S破损方式的拟合曲线为 Q=2.821t-13.03(r2=0.9743)，Js为2.821ng/(cm·h)、Tlag为4.62h. 3讨论 经皮外用制剂的安全性评价常因其剂型、给药途径等特殊性而具一定 难度，给药后的实际剂量及毒性暴露量和毒性反应程度主要取决于透入皮肤的实际药量，其透皮吸收率常受皮肤屏障功能状态(包括不同种系、不同体位、不同 疾病下的皮肤角质层状态)及给药方法的限制;此外，经皮给药制剂的透皮吸收过 程除了受药物本身的性质、透皮制剂剂型、透皮促进剂及基质等方面的影响，还 因为主要吸收屏障–皮肤的病变改变了正常皮肤屏障的完整性和药物通透性，使 药物吸收速度相比屏障功能正常的皮肤有不同程度增加，进而可能导致潜在过敏 性及其他毒副作用的发生率增加。
因此，在经皮制剂安全性评价研究中必须注意与临床实际情况相吻合 并考虑如何采取更接近实际的措施，如动物皮肤病理状态、透皮方式等方面均存 在如何模拟临床的问题。由于毒理实验中皮肤脱毛和破损皮肤制备时，往往会忽 略破损皮肤制备方法的异同对试验结果潜在的影响，主观认为常规方法均能使皮 肤破损并获得理想程度，而忽视了常规方法凭经验操作制备得到的破损皮肤可能 存在明显差异，这种差异一旦影响到透皮渗透速率，即会导致药物在动物体内的 暴露量产生差异，将无法明确诠释药物经皮吸收后的症状反应及程度与药物经皮 给予剂量、实际剂量和毒性暴露量的相关性，从而可能致安全性评价的结果不准 确。故经皮给药制剂毒性试验以皮肤损伤的模拟操作最关键。
本实验通过对比3种常见的破损皮肤制备方法，发现3种方法在操作时 均能以肉眼直观的观察到皮肤有明显破损，但破损程度因人员及操作标准的异同 等其他影响因素而难以控制。因此，为了确定上述各方法所获皮肤的破损程度是 否适宜(即以损伤表皮为度)，对所获破损皮肤均进行了组织病理学检查。
组织病理检查结果分析显示：①砂纸打磨至皮肤发红时，镜下皮肤破 损程度比较适宜，可见局部表皮缺失，真皮完好。②与肉眼的直观判断恰恰相反， 针头划伤破损皮肤镜检则显示皮肤基本完好，这可能是因为该方式对皮肤的破损 为非连续性，导致皮肤损伤密度与其他方式具明显差异，再受病理取材限制(即 无法大量连续切片)，取材具一定随机性且未对其他部位重新取材，故病理检查 结果与实际的皮肤破损程度不吻合。因此，在这种情况下应结合破损皮肤的实际 操作情况和肉眼观察结果进行判断，最好能准确定位皮肤局部破损位置并重新取 材进行病理学检查，以进一步确定破损程度是否适宜。③用4%Na2S涂覆5min, 肉眼观察皮肤可见散在出血点，镜下可见皮肤有破损，且破损程度稍重，可导致 真皮浅层缺失;另有文献报道[8],用8%的Na2S脱毛，可确保大鼠皮肤角质层不受 破坏，而本实验用4%Na2S却使家兔的皮肤受到过度破损，这可能与操作时Na2S 停留在皮肤的时间、大鼠角质层与家兔厚度的差异有关。提示用Na2S对完整皮 肤组实验动物脱毛操作时，也应注意其对动物皮肤可能会造成不同程度损伤。体外透皮实验结果分析显示，3种方法制备获得的破损皮肤用于草乌 甲素凝胶膏体外透皮试验，其中，针头划伤得到的Js为96.82ng/(cm·h)、砂纸打磨 得到的Js为210.2ng/(cm·h)、4%Na2S脱毛剂得到的Js为2.821ng/(cm·h)，3种破损方 式透过率存在较大差异。进一步分析导致这种差异的原因，认为可能是由于针头 划伤导致的皮肤破损为非连续性，破损密度低，且有较大面积的皮肤因未受到有 效破坏使角质层仍得以保留，而角质层是药物渗透过皮肤的最大障碍[9-10],也是 经皮给药制剂透过率及其毒性暴露量和安全性评价的最大影响因素;4%Na2S涂 覆5min,镜检显示皮肤已被过度破损，理论上渗透速率应不会低，但上述结果表 明其渗透速率却是3种破损方式中最低的，结合前期实验数据发现草乌甲素在碱 性条件中不稳定、分子结构极易破坏的情况，分析此现象可能为Na2S破损皮肤 时因局部皮肤吸附部分Na2S而呈现一定碱性环境，从而使草乌甲素于透皮过程 中受到相应破坏所致。是否确切，有待将来研究中作进一步验证。
此外，体外透皮实验时扩散池的温度、接受液的种类、制备皮肤的储 存条件、实验时皮肤在一定时间内生理活性改变等诸多方面的因素，均会不同程 度影响皮肤透过率的检测结果[6],但因本实验主要目的是平行比较皮肤不同破损 方式下同一制剂的透过率差异，故上述影响因素在此实验中未过多关注。
综上分析提示，用砂纸打磨的方式获取的破损皮肤，应为毒理试验用 于模拟临床皮肤损伤病理状态中较理想的方式之一，但实际操作时，应在SOP中 明确规定砂纸的规格型号和打磨终点的肉眼判断标准。考虑动物皮肤损伤程度及 其透过率的影响因素非常多，药物离体破损皮肤的体外透皮试验结果与在体破损 皮肤的透皮试验结果可能会有较大差异，故在今后的试验中还需针对各影响因素 进行更深入细致的研究，以期更全面获取经皮给药制剂的药物代谢特征，为经皮 制剂的毒理研究和安全性评价提供科学的技术支持。