乳腺癌_乳腺癌及癌旁组织中VEGF及survivin2B,mRNA的表达意

乳腺癌及癌旁组织中VEGF及survivin2B mRNA的表达意

乳腺癌及癌旁组织中VEGF及survivin  2B mRNA的表达意 【摘要】 目的：
观察乳腺癌及癌旁组织中vegf及survivin  2b mrna表达 情况，并探讨其与临床病理学指标的关系. 方法：
以逆转录  聚合酶链反应 （rt  pcr）法检测60例乳腺癌及癌旁5 cm正常乳腺组织标本vegf及凋亡抑制因子 survivin剪接体survivin  2b mrna表达，半定量分析电泳结果. 结果：
在60例乳腺 癌标本中vegf及survivin剪接体survivin  2b mrna均高表达，与癌旁正常乳腺组织 中差异有统计学意义（p0.01）, vegf mrna及survivin  2b在乳腺癌组织中的高表达 呈正相关（r=0.576, p0.05），同时vegf及survivin  2b mrna的表达与淋巴结转移 有关（r=0.482，p0.05）. 结论：
vegf及survivin  2b因子为乳腺癌发生、发展过 程中的重要因子，可对患者的治疗及预后作预测. 【关键词】 乳腺肿瘤 基因 血管内皮生长因子类 survivin 0引言 随着人民生活水平的提高，生活环境的变化及各种影像学检查的完备，乳 腺癌检出率逐步提高,近年来其发病率呈明显上升趋势，已列为女性恶性肿瘤的 首位. 如何尽早发现乳腺病变成为目前重要的研究课题. 肿瘤的发生和发展是一 个多基因和环境因素参与的过程，研究证实肿瘤的生长有赖于血管向其提供充足 的营养，为其细胞增殖、侵袭和转移提供必要的物资条件. survivin  2b是近年来 发现的survivin［抗凋亡因子，凋亡抑制家族（iap）中的新成员］的剪接体，是 survivin中最具特异性因子［1］. 我们采用rt  pcr检测乳腺癌及癌旁正常乳腺组 织中vegf及survivin  2b的扩增情况，与临床病理学指标对比分析，以探讨vegf 及survivin  2b与乳腺癌浸润和转移的关系. 1材料和方法 1.1材料我院2002  05/2008  03乳腺癌患者切除的癌组织及距肿瘤5 cm的 癌旁非癌乳腺组织标本，能进行随访并经病理证实为乳腺癌的石蜡包埋组标本60 例，均为女性，术前均未行化疗、放疗和内分泌治疗. 患者年龄25～68（平均48） 岁. ⅰ期11例，ⅱ期39例，ⅲ期10例. 原位癌38例，有腋窝淋巴结转移的22例. 行 乳腺癌根治术12例，改良根治术48例. trizol试剂盒（美国invitrogen公司），m  mlv 逆转录酶，rnasin和gotaq green master mix均购自美国promega公司. 引物由上海生 工公司合成. 梯度pcr仪及凝胶成像系统quantity one version 4.6.3（美国bio  rad 公司）.1.2方法vegf上游引物5′  ggagcttcaggacattgctgtg  3′，下游引物为 5′  ggaggaaggtcaaccactcac  3′, 扩增片段353 bp, 由于survivin共有5条条带，故设 计引物控制能出现的条带为survivin及其剪接体survivin  △ex3,survivin  2b 3条 条带，共有上游引物为5′  gagaacgagccagacttggc  3，下游引物为 5′  cctctggtgccactttcaaga  3′，扩增片段461 bp，344 bp，530 bp. gapdh上游引物 为5′  agtccactggcgtcttcac  3′，下游引物为5′  gcttgacaaagtggtcgttgag  3′;扩增片 段639 bp. 用trizol试剂提取乳腺癌、癌旁组织总rna. rna纯度a260/a280均在1.8～ 2.0之间. rt反应体系：模板rna 2 μg， oligo  dt18 0.5 μg，70℃变性5 min,冰上冷 却5 min，加入5×rt缓冲液5 μl, dntps 1.25 μl(each 10 mmol/l), rnasin 416.75 nkat, m  mlv 3334 nkat，1 ml/l depc水补至反应终体积25 μl，42℃反应60 min，72℃反 应15 min，合成的cdna置-20℃保存. pcr反应体系：在反应体系25 μl中gotaq green master mix 12.5 μl，上下游引物各0.8 μmol/l，cdna 1.5 μl，nuclease  free water 7.0 μl，入pcr仪. 反应条件：95℃预变性2 min，95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s， 共40个循环，72℃延伸 5 min. 取10 μl pcr产物在含有溴化已锭的10 g/l琼脂糖凝 胶上电泳，5 v/cm，在凝胶成像系统下成像分析. 将gapdh条带的吸光度值定为10， 取目的基因条带与gapdh条带吸光度值的比值作为目的基因的相对值. 统计学处理：采用秩和检验方法，用spss11.5统计软件进行统计学分析. 2结果 2.1乳腺癌组织与癌旁5 cm正常乳腺组织中vegf，survivin  2b转录情况由 于survivin  2b及survivin  △ex3均为survivin的剪接体，故出现三条带（图1）. vegf 及survivin  2b mrna在乳腺癌组织中均有较高表达，在癌旁5 cm正常乳腺组织中 均低表达，差异有统计学意义（p0.05，表1）. 1: marker;
2~11: vegf在癌旁组织的表达;
12~16: vegf在癌组织的表达. gapdh: 癌组织参考物. 图1乳腺癌组织中vegf及survivin  2b的表达 表1乳腺癌与癌旁组织中vegf及survivin  2b mrna的表达指标〖〗组织〖 〗平均秩序〖〗表达数〖〗z*〖〗pvegf〖〗乳腺癌〖〗47.53〖〗45〖〗-2.001 〖〗0.031〖〗癌旁〖〗58.42survivin  2b〖〗乳腺癌〖〗45.62〖〗34〖〗-2.345 〖〗0.040〖〗癌旁〖〗57.68*：数据非正态分布，采用秩和检验.2.2乳腺癌组织中survivin及其剪接体survivin  △ex3,survivin  2b转录与临 床病理学指标的关系淋巴结转移与vegf及survivin  2b的表达相关(p0.05)；
临床病 理学分期、肿块大小与标本中vegf表达相关，临床病理学分期、年龄、肿块大小 与标本中survivin  2b mrna表达无关（表2）.表2vegf及survivin  2b mrna在癌组 织中表达与临床病理学指标的关系临床病理 3讨论 vegf又称血管内皮细胞生长因子，特异性地作用于血管内皮，促进血管内 皮细胞增殖，并在体内诱导血管形成. 我们发现，vegf在乳腺癌组织中的阳性表 达明显高于癌旁组织(p0.05)，乳腺癌组织中vegf阳性表达率为75％. 同时vegf的 表达与肿瘤直径大小存在相关性，这与文献［2］存在不同，分析原因在于其采 用的为免疫组化的方式，在计数上和观察上与rt  pcr的方式存在不同. 而存在淋 巴结转移者vegf的表达率明显高于无淋巴结转移者(p0.05). 随着临床分期的升高 vegf的阳性率逐渐上升(p0.05). 这些表明vegf在乳腺癌的进展过程中起重要作用， 与肿瘤的浸润转移密切相关. 生存素(survivin)是凋亡抑制蛋白(inhititor of apoptosis protein, iap)家族的 一个新成员，主要分布在胚胎及分化未成熟的组织，高表达于多种恶性肿瘤组织， 而在终末分化的正常成熟组织中不表达［3］. 这些功能和分布特点提示生存素 与肿瘤的发生、发展密切相关. 人的生存素基因有4个明显的（1,2,3和4）和2个 隐藏的（2b和3b）外显子［4］. 生存素前提rna的选择性剪接生成了4个不同的剪 接变体，导致相应的蛋白质结构发生显著变化［5-6］. survivin  2b为survivin的 一个剪接变体，其保留部分内含子2作为隐蔽的外显子，导致相应的蛋白质结构 发生显著的变化，因此无抗凋亡功能甚至有负调控功能［7］；
本研究中 survivin  2b在乳腺癌组织中的阳性表达明显高于癌旁组织(p0.05)；
survivin  2b 与乳腺癌患者年龄及肿块大小无特异的相关性；
survivin  2b与淋巴结转移相关 (p0.05). 本研究同时显示，survivin  2b表达与乳腺癌患者的临床病理学分期无 关. 总之，vegf及survivin剪接体survivin  2b因子是乳腺癌发生、发展过程中 的重要因子，与其他预后指标联合检测可望对患者的治疗以及预后作出更准确的 预测.