麝香壮骨膏控制菌检查的方法学验证
麝香壮骨膏控制菌检查的方法学验证 橡胶膏剂是指药物或药材提取物与橡胶为主的基质混合后，涂布于裱背材 料上的外用剂型。麝香壮骨膏为片状橡胶膏剂，具有镇痛、消炎之功效，用于风 湿痛、关节痛、腰痛、神经痛、肌肉酸痛、扭伤、挫伤。《中国药典》(2010 年 版)一部对橡胶膏剂新增微生物限度检查项目，每 10 cm2不得检出控制菌(金黄 色葡萄球菌和铜绿假单胞菌)。按照《中国药典》(2010 年版)一部附录 II 及附 录 XIII的要求，对麝香壮骨膏进行了微生物限度检查方法及方法学验证的试验 研究，建立了麝香壮骨膏控制菌的检查方法。1 仪器与材料 1.1 仪器 仪器采用 SHZ-82A 型水浴恒温振荡器(金坛市城西天竟实验仪 器厂);YXQ-LS-50 型立式自动电热压力蒸汽消毒器(上海博迅实业有限公司医疗 设备厂);DHP-600 电热恒温培养箱(北京永光明医疗设备厂);DHG-9075A 型电热 恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)。
1.2 样品 样品为麝香壮骨膏(东阿阿胶医疗器械有限公司药业分公司国药 准字：批号：12020112、12020805、12020705)，主要成份：人工麝香、生川乌、 生草乌、薄荷脑、水杨酸甲酯、冰片、山奈、白芷、樟脑、硫酸软骨素、盐酸苯 海拉明、麻黄、八角茴香、苍术、当归、干姜。
1.3 菌种与培养基 大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、金黄色葡萄球菌 [CMCC(B)26003]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)64941]、枯草芽孢杆菌 [(CMCC(B)63501]、白色念珠菌[(CMCC(F)98001]、黑曲霉[(CMCC(F)98003]，以 上菌种均购自中国药品生物制品检定所，传代次数不超过五代。培养基为营养肉 汤培养基、胆盐乳糖培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、溴化十六烷基三甲铵琼 脂培养基、营养琼脂培养基(批号分别为 1203132、1003182、100129、1110082、 1103162)均为北京三药科技开发公司生产。0.9%氯化钠注射液，pH7.0 氯化钠- 蛋白胨缓冲液和聚山梨酯-80 均按《中国药典》(2010 年版)一部附录配制。
2 方法与结果 2.1 验证用菌液的制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞 菌的新鲜培养物于营养肉汤培养基中，恒温培养箱 30～35 ℃培养 18～24 h。
将上述三种培养物用0.9%氯化钠注射液稀释为每1 ml含菌数为 10～100 cfu 的菌悬液作为验证用菌液。
2.2 供试液制备 2.2.1 稀释剂制备 配制各种稀释液，pH 7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液 200 ml， 分别加入 5 g、10 g、20 g、30 g 和 40 g 聚山梨酯-80，混匀;对麝香壮骨膏进行 供试液制备试验，采用振荡法观察分散情况，确定合适的稀释剂。结果聚山梨酯 -80 为 30 g 和 40 g 供试液较黏稠且有明显的油水分层，影响供试液的吸取， 不便于检验操作;聚山梨酯-80 为 5 g 和 10 g 的供试液均较澄清，溶解不充分。
所以最终选用 pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液200 ml加入20 g聚山梨酯-80作为稀释 剂。
2.2.2 供试液制备 取供试品 4 贴，去掉保护层，放置在无菌玻璃器具上， 粘贴面向上。用无菌纱布覆盖粘贴面，共剪取大小约 100 cm2的块状，然后将其 置于 100 ml 稀释剂中，置 40 ℃水浴恒温振荡器中，频率为 200 转/分，振荡 30 min，制成 1:10的供试液。
2.2.3 阴性对照 稀释剂作为阴性对照液 2.3 试验方法 2.3.1 金黄色葡萄球菌 试验组：分别取供试液 10ml 和 1 ml 的金黄色葡 萄球菌验证菌液，加入 100 ml营养肉汤培养基中;供试品组：取 1 供试液 10ml 加入 100ml 营养肉汤培养基中;阴性菌对照组：分别取供试液 10 ml 和 1 ml 的 大肠埃希菌验证菌液，加入 100 ml 营养肉汤培养基中;阴性对照组：阴性对照液 10 ml 加入 100 ml 营养肉汤培养基中。上述各组置 30～35 ℃恒温培养箱内培 养 24～48 h，分离划线于甘露醇氯化钠琼脂平板上，依照金黄色葡萄球菌的检 查方法进行检查。
2.3.2 铜绿假单胞菌 试验组：分别取供试液 10 ml和 1 ml 的铜绿假单胞 菌验证菌液，加入 100 ml 胆盐乳糖培养基;供试品组：取供试液 10 ml 加入 100 ml胆盐乳糖培养基;阴性菌对照组：分别取供试液10 ml和 1ml 的大肠埃希菌验 证菌液，加入 100 ml 胆盐乳糖培养基;阴性对照组：阴性对照液 10 ml 加入 100ml 胆盐乳糖培养基。上述各组置 30～35 ℃恒温培养箱内培养 24～48 h， 分离划线于溴化十六烷基三甲铵琼脂平板上，依照铜绿假单胞菌的检查方法进行 查。3 分析与讨论 橡胶膏剂中除了主要药用成份外，基质主要为橡胶、凡士林、液状石蜡和 羊毛脂等高分子材料，因此选用合适的溶剂来制备供试液，是橡胶膏剂微生物限 度检查中制备供试品溶液很关键的步骤。因橡胶、松香、松香衍生物、凡士林、 羊毛脂等橡胶膏剂基质试验中不易找到可使背衬层与药物贴库层、粘胶层分离的 适宜溶剂，故选用 pH 值为 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液200 ml加入20 g聚山梨酯 -80作为稀释剂，通过振荡可使大部分药物贴库层中可能存在的菌体沉降入水相 中。
配制稀释剂时比较振荡法与均质器拍击法，采用均质器拍击法时，若时间 小于 3 min，分散结果不太理想;但延长拍击时间就会不同程度的出现胶黏团，影 响供试液吸取。另外均质器拍击法无菌操作的安全性与简便性不如振荡法。综合 考虑，试验选用振荡法。
麝香壮骨膏成分中均含有冰片，具有抑菌作用。但因控制菌检查时，供试 品溶液的浓度为 1:10，且只取 10 ml 加入至 100 ml 的相应培养基中，冰片的 浓度比较低，所以控制菌的生长未受到影响。
按照中国药典 2010 年版的要求，通过对麝香壮骨膏进行微生物限度检查 方法学验证试验，结果表明，对本品金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的检查，均 可采用常规法进行检验。