不同相对分子质量海带岩藻聚糖硫酸酯内皮细胞
不同相对分子质量海带岩藻聚糖硫酸酯内皮细胞 岩藻聚糖硫酸酯（fucoidan)是一种水溶性硫酸 杂聚糖,是褐藻特有的 一种化学组分。据初步的药理 研究发现1—8 ,它具备抗凝血、抗肿瘤、抗HIV、 抗血栓、提高免疫力、降血脂等多种医学功效,是当今天然 海洋药物研究的重点 之一。血栓形成的最主要因素 是血管受到损伤,其中首当其冲的就是血管内皮细 胞的损伤5。因此,判断一种药物是否可作为理想的抗 血栓药物,也应该对其是否 具有保护血管内皮细胞的 功能进行考察。有报道称,海带中提取的高分子杂多 糖对血管内皮细胞可能具有保护作用6,在作者的前 期研究中,发现中、低相对分 子质量的海带岩藻聚糖 硫酸酯均具有良好的抗血栓作用—]。而其是否对内 皮 细胞具有保护作用，尚待进一步研究。本实验同时 采用体内研究和体外研究的 方法,考察不同相对分子 质量海带岩藻聚糖硫酸酯对内皮细胞的保护作用，并 探讨其作用机制,为开发抗血栓新药提供理论支持。1材料 1.1 动物SD大鼠,雄性,清洁级,200 ~250 g青岛市药 检所实验动物中心,动 物生产许可证号:SCXK (鲁） 20090007]。
1.2细胞株人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endo¬thelial cell, HUVEC,上海泛柯生物科技公司）细胞 株取自人脐带静脉组织,为原代冻存细胞。
1.3药品与试剂4种岩藻聚糖硫酸酯（中国海洋大学食品科学 与工程 学院）。相对低相对分子质量岩藻聚糖硫酸 酯（low molecular weight fucoidan, LMWF) : LF1 (相对 分子质量3 700,硫酸根含量30. 7%) ;
LF2 (相对分 子质量7 300,硫酸根含量32.5%);相对中相对分 子质量岩藻聚糖硫酸酯（middle molecular weight fu¬coidans, MMWF) ：MFa (相对分子质量19 000,硫酸 根含量28.5%) ;
MFb (相对分子质量28 000,硫酸 根含量34.6%)。分别用生理盐水配成0.6 ^mol • L-1溶液备用。血管性血友病因子测定药盒（上海 船夫生物科技有限公司）；
水 合氯醛、磷酸盐缓冲液 (PBS)及其他试剂均为国产分析纯。大鼠抗人单克 隆抗 体 CD31—PE、CD514TTC (美国 Invitrogen 公 司）;高糖DMEM培养基（美国Gibco公司）；
小牛血 清（杭州四季青生物工程材料公司）;胰蛋白酶（美 国DFICO 公司）；
肿瘤坏死因子（TNF—a)(华美生 物工程有限公司）；
鞘液（美国BECKMAN COUL¬TER 公司，ISOTON 1);标准荧光微球（美国BECK- MAN COULTER 公 司 , FLOW-CHECK) 。
1.4主要仪器全自动石蜡切片机（德国SLEE公司，6022 型）;光学显 微镜（OLMRAS公司，日本）；
高速冷冻 离心机（上海安亭科学仪器厂,TGL -16G-A);全 自动酶标仪（BECKMAN COULTER公司,AD340,美 国）；
CO2孵育 箱（美国Themro Fomra公司， Model311);流式细胞仪（美国 BECKMAN COULTER 公司，Epics XL • MCL)。
2方法 2.1分组与给药大鼠随机分为正常对照组、模型组和4个岩藻 聚糖磷酸酯 组（分别为LF1组、LF2组、MFa组和 MFb组），每组10只，全部为雄性。正常 对照组和 模型组腹腔注射给予1 mL • 100 g-1生理盐水,其他 各组分别腹腔注射 给予岩藻聚糖硫酸酯0. 01 ^mol •kg-1,每日1次,持续5 d。
2.2大鼠内皮损伤模型制作3各岩藻聚糖硫酸酯实验组和模型组分别 在每日 早、中、晚于背部相同部位皮下注射肾上腺素（0.4 mg • kg — 1),正常对 照组皮下注射等量生理盐水，持 续5d。每日早晨给药1h后麻醉,腹主动脉取血约 2 mL,置枸橼酸钠抗凝管（抗凝剂与血样体积比为 1:9)中备用。
2.3病理学切片制作大鼠取血后,快速分离胸主动脉,先用磷酸盐缓 冲 液冲洗干净管腔内的血液，再用4%多聚甲醛固 定24 h。横截切取主动脉弓下血 管段约0.5 cm,经 包埋后切片，切片厚度5 pm。经HE染色后,进行脱 水透明、封 固，备用。
2.4内皮损伤情况切片观察和血管性血友病因子 (vWF)的测定内皮损伤情况切片观察：将病理学切片置光学 显微镜下观察内皮损伤情况。大鼠血浆 vWF的测 定:将抽取的各时段抗凝血,3 000 r • min-1,离心10 min。采用酶联免疫 法（ELISA)按照试剂盒操作说 明，测定血浆VWF水平。
2.5人脐静脉内皮细胞的培养a14a细胞复苏后,加入高糖DMEM培养液 约5 mL, 培养瓶中接种,每3 ~4 d换液1次。待内皮细胞生 长铺满瓶底后即可传代。
吸去培养基，用无血清 RPMI 1640 2 mL洗培养瓶1次。加入0. 1%胰酶、0. 02%EDTA-Na- 3 mL,放 CO2孵育箱（5% CO2, 37 °C)中培养,隔天换液,约4 d进行 1次消化传代。取 对数生长期细胞,经消化、离心后,弃去上清液,加入 冻存液,调 节细胞约为1 x 107个• L―1,冷冻,备用。
2.6 vWF和EMPs指标检测 2.6.1vWF水平检测0 将上述培养的内皮细胞• 2113 •Chin Pharm J, 2015 December, Vol. 50 No. 24按5 x105接种于24孔细胞培养板,并随机分为下列 各组, 每组样本数为8。接种24 h后弃全部上清液， 按以下实验分组要求加入实验培养 液:①正常对照 组:加入完全培养液;②模型组:培养液中加入肾上 腺素,使最终质 量浓度为10 mg • L-1;③LF1组:培养 液中加入LF1和肾上腺素,使最终浓度分别为 0. 01 ^mol • L-1和10 mg • L-1;④LF2组:培养液中加入 LF2和肾上腺素,使最终浓 度分别为0. 01 ^mol • L-1 和10 mg • L-1;⑤MFa组:培养液中加入MFa和肾上 腺 素,使最终浓度分别为0.01 ^mol • L-1和10 g • L-1;⑥MFb组:培养液中加入MFb和 肾上腺素,使最 终浓度分别为0. 01 ^mol • L-1和10 g • L-1。分别在加药后的24和 48 h取100 ^L上清液， 采用酶联免疫吸附试验（ELISA),按照试剂盒说明 测定 vWF水平。
2.6.2EMPs检测将体外培养生长良好的内皮细 胞按5 x105个接种于 24孔细胞培养板,并随机分为 下列各组,每组样本数为3。接种24 h后弃去上清 液, 按以下实验分组要求加入实验培养液:①正常对 照组：加入完全培养液；
②模型 组：培养液中加入 TNF-a( 100 ng • mL-1)；
③LF1组：培养液中加入 LF1和TNF—a, 使最终浓度分别为0. 01 ^mol • L-1 和100 ng • mL-1;④LF2组：培养液中加入LF2 和 TNF—a,使最终浓度分别为0.01 ^mol • L-1和100 ng • mL-1;⑤MFa组：培养液中加入MFa和TNF- a,使最终浓度分别为0.01門l • L-1和100 ng • mL-1;⑥MFb组：
培养液中加入MFa和TNF—a,使 最终浓度分别为0. 01 ^mol • L-1和100 ng • mL-1。
药品加入完成后，于37 C剌激人脐静脉内皮细 胞24 h ,按文献1344]方法采用流式 细胞仪进行 检测和分析。
2.7数据统计分析与处理各组数据以x ± s表示，用SPSS11. 5统计分析 软件,以单因素方差分析和q检验进行统计比较。
3 结果 3.1 光学显微镜下病理检查结果造模5 d后，各组胸主动脉HE染色后切片 的 光学显微镜下结果见图1。正常对照组胸主动脉有 较完整的内皮层，表面光 滑;模型组可见内皮层有严 重的脱落或断裂；
而LF1组合LF2组有内皮层断 裂, 未见脱落现象；
MFa组合MFb组有内皮层有少 许断裂,分离现象，内皮损伤较LF1 和LF2组较重， 但较模型组为轻。说明反复注射较大剂量的肾上腺• 2114 •Chin Pharm J, 2015 December, Vol. 50 No. 24素可造成血管内皮的损伤，而LMWF能够 对抗这种 由肾上腺素造成的血管内皮损伤，具有内皮细胞保 护作用，且其内皮 的保护作用明显强于MMWF。
3.2 大鼠血浆vWF浓度大鼠注射肾上腺素的5 d时间里，正常对照组 的vWF水平基本没有变化。模型组的血浆vWF浓 度先降低,然后逐渐升高,在第5 天与正常对照组比 较，出现明显差异（P 0. 05) ;
LMWF组的vWF水 平逐日降低， 与当日正常对照组相比,均无统计学差 异,第5天与当日模型组相比，血浆vWF浓 度出现 明显差异（P 0. 05)。各MMWF组的vWF水平呈 逐渐升高状态，但与当 日正常对照组和模型组相 比，均无统计学差异。结果提示，LMWF均能够降 低 血管内皮损伤大鼠血浆中vWF的水平。结果见 表1。
模型组中vWF水平从第1天的较高水平到第2 天先有一个降低,然后 从第3天起又开始逐渐升高。
可能是由于在首次大剂量注射肾上腺素剌激导致的 应激反应,而这一升高在机体自身调节的情况下,逐 渐恢复。但是，伴随着血管内皮损伤的加重，vWF 水平再次逐渐升高，则表明此时内皮细胞损伤已经 逐渐发 展成为了一个不可逆的病理过程。
3. 3体外岩藻聚糖硫酸酯对肾上腺素剌激内皮细 胞释放vWF的影响 正常对照组培养上清液中培养24和48 h的 vWF含量随时间推移，逐渐升高；
模 型组与同时段 正常对照组相比,vWF水平均显著升高（P 0.01);
与同时段模型组 比较,LMWF组均能够使24和48 h 培养液的vWF含量明显降低（P 0. 01),而 MMWF 组vWF水平与模型组无统计学差异。见表2。
3. 4体外岩藻聚糖硫酸酯对TNF—a剌激释放内皮 细胞微颗粒的影响 人脐静脉内皮细胞生成的微颗粒CD31及 CD51表达阳性。模型组受TNF—a剌激 后，组内皮 细胞微颗粒水平显著高于正常对照组（P 0.01);
LMWF组的内皮微颗 粒数目显著低于模型组 (P 0. 01),而与正常对照组无统计学差异；
MMWF 组的内 皮微颗粒数目比正常对照组明显增多 (P 0. 01),数目虽比模型组有所减少,但无统 计学 差异（P 0.05)。提示低相对分子质量的岩藻聚糖 硫酸酯可减少TNF—a剌 激引起的内皮微颗粒脱落。
数据见表3。
4讨论 当血管壁受到某些因素的剌激后，尤其是血管 壁结构完整性遭到破坏时, 就会暴露出胶原和组织 因子，胶原可激活血小板体系使其凝聚，组织因子 可激 活凝血体系经过一系列级联反应使纤维蛋白原转化成纤维蛋白，导致血栓形成。
由此可见,对血管 内皮的保护是防止血栓形成的一个重要途径。
本实验同时采用体内研究和体外研究的方法, 探讨了不同相对分子 质量海带岩藻聚糖硫酸酯对内 皮细胞的保护作用。在体内研究中，我们通过制 作 苏木精-伊红（hematoxylin—sosin, HE)染色切片，在 光学显微镜下观察了大 鼠胸主动脉内皮层的变化, 可直观的看出，LMWF对大鼠血管内皮细胞具有明 显保护作用，且其保护作用强于MMWF。另外,在体内实验中，采用vWF作为内皮损伤 指标,定量考察了不同相 对分子质量岩藻聚糖硫酸 酯对内皮细胞的保护作用。vWF又称因子V1相关 抗 原，主要由内皮细胞分泌，可参与血小板的黏附反 应。vWF所介导的血小板与 损伤血管壁黏附的过 程是影响血栓形成重要而关键的一步。当血管受损 时,vWF就会沉积在血管损伤部位，并与特定的血 小板膜受体结合,从而介导血小 板黏附于血管内膜 下层，并启动血栓形成。换言之，vWF是血小板黏 附到损伤 血管内皮之间的桥梁548。本实验的体 内研究结果证明，LMWF具有降低vWF 水平的功 能,而MMWF虽然可一定程度上降低vWF水平，但 与模型组比较,差异 无统计学意义。
在本实验中，通过体外培养人脐静脉内皮细胞应用肾上腺素造成损伤， 测定vWF水平，所得结论 与体内研究结果相同。说明无论是在体内还是体 外,LMWF均可降低由于肾上腺素损伤所造成的 [8 ] vWF分泌增高，比较而言， MMWF抑制内皮细胞分 泌vWF的作用要弱得多。
本实验采用内皮细胞黏附分子（CD31)和玻连 [9] 蛋白（CD51)双阳 性鉴定法M ,利用流式细胞仪,检 测了细胞培养液中岩藻聚糖硫酸酯对内皮细胞 释放 EMPs的抑制作用。实验发现,LMWF可显著抑制由 [10] TNF-a剌激产生的 EMPs,而MMWF对EMPs的产 生没有抑制作用 。
11本实验结果表明，LMWF 对内皮细胞具有良好 的保护作用；
而MMWF虽然对内皮细胞的损伤有所[12]改 善,但这种保护作用远低于LMWF。同时可以推 断出，LMWF可通过降低EMPs 浓度和vWF浓度，阻断血小板与受损血管部位的胶原结合,从而抑制 13 血小板 活化,发挥保护内皮的作用。