无花果多糖提取工艺及其功能讨论
无花果多糖提取工艺及其功能讨论 糖尿病(diabetes mellitus，DM)及其并发症已成为继心脑血管疾病、肿瘤之 后严重危害人类健康的第三大常见病，据世界卫生组织(WHO)报告，全世界目前 约有1.5亿DM 患者，预测2025年将上升到3亿，近年糖尿病及其病发症的发生率 越来越高.糖尿病慢性并发症的发生和发展与整体血糖水平的升高有密切的关系， 同时糖尿病长时间的高糖环境会导致糖脂代谢的紊乱，从而引起脏器病变及并发 症.血液中糖化血红蛋白(HbAlc)与血糖浓度成正比，所以检测血中HbAlc水平可 以直观地反映出血糖水平，更好地监测机体糖代谢的情况.国外有学者研究证实 了HbA1c是诊断血糖水平的重要指标，而且HbA1c与空腹血糖(FBG)、甘油三酯 (TG)低密度脂蛋白(LDL)呈正相关.在控制血糖水平的同时，有效调节血脂代谢紊 乱对治疗糖尿病及其并发症有重要意义.植物多糖在自然界中广泛存在，具有降 血糖、提高免疫力、防止心肌缺血等复杂的生物活性与功能，它能促进胰岛素分 泌，提高血浆胰岛素水平，抑制糖异生途径和调控糖原的合成、分解及促进血糖 利用.目前，市场上治疗糖尿病的药物主要是化学合成药，虽然短期疗效显著， 但常伴有不同程度的副作用，如心血管疾病、过敏反应等. 无花果(Ficus carica)为桑科无花果属植物的果实，在甘肃省陇南市白龙江 两岸栽培面积约有333.3hm2，是甘肃省主要的无花果栽培基地.无花果营养丰富， 无花果多糖系其主要有效成分，但是由于其水溶性和分子量大，给提取纯化带来 了困难.近年来有关无花果多糖提取工艺研究的报道较多，但仅限于压榨、水溶 和溶剂萃取等传统提取方法的研究，而且传统提取工艺复杂、提取率低、耗时也 较长.同其他植物多糖一样具有复杂的生物活性与功能，有关无花果多糖在降血 压、防治神经痛、抗凝血、抗血栓、抗氧化、增强免疫力方面的研究逐渐增多， 而关于无花果多糖在降血糖、血脂方面的研究较少.鉴于此，试验根据无花果多 糖特点，用酶法和响应面法联用，进行提取工艺优化研究，并采用ALX诱导建立 糖尿病大鼠模型来观察无花果多糖对糖尿病大鼠降血糖和降血脂的作用效果，以 期开发无毒无副作用的降糖替代药物，对无花果多糖综合开发提供科学依据，促 进无花果产业经济的发展. 1 材料与方法 1.1 材料与仪器 1.1.1 试验材料与动物无花果采自甘肃省陇南市武都区白龙江沿岸，品种为紫果，挑选大小均匀 成熟度相同，无机械损伤，颜色鲜艳，无病虫害的果实;SD大鼠，雄性，合格证 号SCXK(甘)2009-0004，体质量185～220g，试验动物和饲料均购自兰州大学基 础医学院医学实验中心. 1.1.2 试验药品 四氧嘧啶，Sigma公司;盐酸二甲双胍片，上海医药(集团)有限公司信谊制 药总厂生产;格列苯脲片，上海信谊药厂有限公司生产;血糖试纸，爱奥乐医疗器 械(深圳)有限公司;普鲁卡因肾上腺素注射液，远大医药(中国)有限公司生产;苯酚、 浓硫酸、葡萄糖(纯度99.99%，sigam 公司)，复合酶(纤维素酶40万/mL，木聚糖 酶260万/mL，果胶酶/mL，三者比为3∶1∶2)和氏璧生物科技有限公司;其他试剂 均为分析纯. 1.1.3 试验仪器 RE52AA 旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂;HH-6数显恒温水浴锅，上海 千载科技有限公司;TGL-16G高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂;UV759紫外- 可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司;TDL-5000B型低速冷冻大容量离 心机，上海安亭科学仪器厂;LGJ-18型冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂;全自动 生化分析仪AU5800，贝克曼库尔特有限公司;全自动血糖检测仪，爱奥乐医疗器 械(深圳)有限公司;LC-6A 高压液相色谱仪(配有RI-10A 示差折光检测器、7725i 手动进样器、CTO-10AS柱温箱、CBM-20A在线控制器和LC-solution分析软件) 日本岛津公司;TSKGel SW3000 和TSK-Gel SW4000 色谱柱日本Tosoh公司等. 1.2 试验方法 1.2.1 无花果多糖的提取流程 将无花果果实在50℃烘干后将其粉碎，过40目筛，用无水乙醇回流脱脂， 50℃时干燥，然后加入一定量的水，在一定温度下添加相应的复合酶进行一定时 间的酶解，通过复合酶的酶解彻底降解无花果中的纤维素和果胶，使无花果多糖 充分溶解便于提取，提取液经过减压浓缩得浓缩液，取上清液与Sevag试剂(氯仿 ∶正丁醇体积比4∶1)按体积比5∶1混合、振荡、离心弃去变性蛋白，重复4次. 合并水层，用95%的乙醇沉淀(体积比3∶1)，5 000r/min离心10min，沉淀物溶于 热水中，搅拌状态下慢慢加入斐林试剂，析出铜络合物，静置1h，倾出上清液，用水洗涤3次，离心分离得络合物，向络合物中加4 ℃蒸馏水，再滴加0.5mol/L 的HCl使之全部溶解，用95% 的乙醇沉淀(体积比3∶1)、离心、所得絮状物分别 用乙醇、丙酮、乙醚洗涤，冷冻干燥得洁白无花果多糖粉. 1.2.2 无花果多糖含量的测定方法 本试验采用苯酚-硫酸法测定总的无花果多糖含量.先把葡萄糖用苯酚、硫 酸试剂处理后，进行紫外扫描，在489nm 处有最大吸收;再利用标准糖浓度和其 用苯酚、硫酸试剂处理后在489nm 处的吸光度制作标准曲线，再测定待测样品 溶液的吸光度，然后根据回归方程计算相应的浓度从而求出多糖含量.无花果多 糖的提取率(%)=样品中多糖的含量稀释倍数样品干质量100%。1.2.3 无花果多糖的单因素试验 分别称取1.0g无花果粉末多份，分别置于250mL锥形瓶中，用100mL蒸馏 水混匀，调节pH 至4.8，备用.用时添加不同酶剂量搅拌均匀后用保鲜膜封口， 置于50℃恒温摇床培养，转速100r/min，酶解24h，以蒸馏水为空白对照，重复5 次.测定酶用量对提取无花果多糖的影响：分别加入0.02、0.04、0.06、0.08、0.09、 0.10、0.11、0.12g工业用复合酶;测定温度对提取无花果多糖的影响：取备用无花 果粉末匀质液体加入工业用复合酶0.06g，温度设置为35、40、45、50、55、60、 66℃的恒温培养箱内酶解;测定pH 对提取无花果多糖的影响：在备用无花果粉末 匀质液体中分别加入工业用复合酶0.06 g，以1 mol/LCH3COOH 溶液和 1mol/LNaOH 溶液调节成pH值分别为4.4、4.6、4.7、4.8、5.0、5.2、5.5、6.0的 系列梯度进行试验.各单因素试验后测定无花果多糖来确定适合的单因素条件. 1.2.4 糖尿病动物模型建立 将SD 大鼠适应性喂养7d，在禁食不禁水12h后，称质量，测量FBG.随机 取10只大鼠作为正常对照组，将其余60只大鼠腹腔一次性注射240 mg/kg 新鲜配 制的3%ALX 溶液.72h后眼眶静脉丛采血，用血糖仪测定FBG，将FBG11.5mmol/L 者视为造模成功.糖尿病模型组，等量生理盐水每天灌胃一次，二甲双胍药物对 照组，按250mg/kg bw，剂量每天灌胃一次，纹党多糖低、中、高剂量组(100、 250、500mg/kg bw)，每天灌胃一次.试验期间，大鼠自由饮食和饮水，连续观察 28d，每隔7d，测定FBG和称量体质量，测定FBG前禁食不禁水12h. 1.2.5 对正常大鼠血糖水平的影响取SD大鼠50只，随机分为5组.空白组(等容量生理盐水)、格列本脲对照组 (2.5mg/kg bw)、纹党多糖低、中、高剂量组(100、250、500mg/kg bw)，各组灌 胃给药、2次/d、连续7d、末次给药前禁食12h，给药后1h眼眶静脉丛采血，用血 糖仪测定FBG的血糖值. 1.2.6 对肾上腺素引起高血糖大鼠血糖水平的影响 取SD大鼠60只，随机分成6组，分组及给药方法同1.2.5，设肾上腺素为对 照组.末次给药前禁食12h，给药后30min各组腹腔注射肾上腺素0.2mg/kg bw， 30min后眼眶采血测定FBG. 1.2.7 大鼠急性毒性试验(LD50)测定 小鼠急性毒性试验，半数致死量(LD50)以纹党多糖一次性灌胃给药，约等 于50mg/10g bw，相当于5 000mg/kg bw，观察28d，看有无异常反应，小鼠是否 活动自如. 1.3 检测指标 末次给药后，各组大鼠禁食不禁水12h，采用血糖仪和血糖试纸，剪尾取 血测各组大鼠FBG;测定FBG后，迅速处死动物并采血，离心收集血清，采用全 自动生化分析仪测TC、TG、HDL、LDL水平. 1.4 统计分析 试验数据均以xs表示，数据分析采用SPSS17.0统计分析软件进行t检验统 计处理. 2 结果与分析 2.1 无花果多糖的纯度检测 无花果多糖溶液的紫外光谱在260nm 和280nm波长处未见蛋白质和核酸 的特征吸收.无花果种子多糖的HPLC-GPC色谱图，只出现一个峰，保留时间为 11.897min，所检测到的峰没有裂峰的出现，说明分离和纯化的无花果种子多糖 是由一种多糖组成的，面积归一化计算纯度为99.95%. 2.2 多糖测定标准曲线的确立以标准液浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度值为纵坐标，得标准 曲线，计算回归方程：y=5.108 6 x+0.006 1，相关系数R2=0.999 9，线性良好. 2.3 影响无花果多糖的单因素试验 不同的酶解温度对无花果多糖溶出率的影响2.45～55℃无花果多糖的提 取率之间差异较为明显，在50℃时无花果多糖的提取率最高.因此，温度选择45℃ 以上，考虑到酶解温度以及能量节约宜选择提取温度为50℃.中可以得出，无花 果多糖含量随着溶液pH 值的增加呈先增加后减少的趋势.当溶液的pH 值达到 4.8时，含量达到最大值.当溶液的pH 值超过5.0时，多糖的溶出率反而减少，说 明这时溶液的pH 值超过酶的最适pH，活性开始降低，所以最佳pH 值为4.8.不 同酶用量对无花果多糖溶出率的影响见图4，无花果多糖溶出率随着复合酶的增 加而增加，无花果多糖在酶用量为0.06g处增加明显，无花果多糖溶出率有最大 值，此后维持稳定.说明此时酶量足够，已经与底物充分作用，因此复合酶的最 佳酶用量为0.06g. 2.4 无花果多糖提取工艺条件响应面分析试验 以单因素试验结果为依据，利用Design Expert8.0.6.1软件设计了三因素三 水平的响应面法试验，以酶解温度、酶用量和pH 为主要考查因素，分别用A、B 和C来表示，并以1、0、-1表示自变量的高低水平，以无花果多糖含量为响应值， 表现出20个试验点.因素水平见表1，试验设计、二次回归拟合及方差分析和结果 见表2，从回归分析中可以得出两者的一次项、二次项均有显著影响.各试验因子 对响应值的影响呈显著的线性关系.各试验因子对无花果多糖(Y)的响应值的影 响分别为：Y =-2591.85+21.84A -1184.86 B +869.78C +2.958AB-0.52AC +237.50 BC -0.19A2 -129.80 B2-89.05 C2.方差分析结果由表3可知，模型P0.01说明酶解温 度、酶用量和pH 及其二次项对无花果多糖的影响极显著，而交互项无显著影响. 无花果多糖模型决定系数为R2=0.999 4，经拟合检验，无花果多糖：P 0.000 1， 差异极显著，由此说明方程能很好地反映无花果多糖含量与酶解温度、酶用量和 pH 之间的关系，而且对无花果多糖提取率影响的大小顺序为A：酶解温度B：酶 用量C：pH.因此，可以应用于无花果多糖含量提取的理论预测.依据回归方程，3 个因素的响应面图如图5-7，相应的响应面均为凹型曲面，说明无花果多糖的含 量响应值存在着极高值，且响应曲面的等高线中心均位于-1～1，说明提取的最 优条件存在于所设计的因素水平范围之内.通过分析两者的响应面分析结果可以 确定，无花果多糖的提取最优工艺参数为：酶解温度为50.36℃，酶用量为0.06g和pH 为4.73，在此条件下，无花果多糖的最高含量为34.47%.无花果多糖提取工 艺优化条件的重复试验验证结果由表4可知，无花果多糖的平均提取率为34.13%， 预测值比较两者无显著差异(P0.05)，所以经过验证此优化条件是最佳组合工艺. 2.5 无花果多糖对正常大鼠血糖水平的影响 格列本脲是降低血糖的特效药物之一，由于其能刺激胰腺分泌胰岛素而降 低血糖，还通过增加门静脉胰岛素水平或对肝脏直接作用，抑制肝糖原分解和糖 原异生作用，也可增加胰外组织对胰岛素的敏感性和糖的利用，而缓解人体高糖 环境，所以医疗使用范围较广.对正常大鼠血糖水平的影响研究结果表明，无花 果多糖低、中、高剂量组均能降低正常大鼠血糖，与空白组比较差异极显著性 (P0.01)，其降糖效果与格列本脲组相当.格列本脲能刺激胰腺胰岛B细胞分泌胰岛 素，还通过增加门静脉胰岛素水平或对肝脏直接作用，抑制肝糖原分解和糖原异 生作用，也可能增加胰外组织对胰岛素的敏感性和糖的利用. 2.6 无花果多糖对肾上腺素引起高血糖大鼠血糖水平影响 肾上腺素是肾上腺髓质分泌物，能使肝糖元分解，阻碍葡萄糖进入肌肉及 脂肪组织细胞，促使血糖升高.对肾上腺素引起高血糖大鼠血糖水平的影响研究 表明，无花果多糖对肾上腺素引起的大鼠血糖升高具有明显的抑制作用，结果见 表6.而这种抑制小鼠糖代谢的作用可能是通过促进胰岛素的释放，提高胰岛素敏 感性，从而增加外周组织对葡萄糖的利用和增加肝糖元合成，调节糖代谢和抑制 糖异生过程来完成降低血糖的作用. 2.7 无花果多糖对糖尿病大鼠血糖的影响ALX 是一种常用的诱导大鼠产生Ⅱ型糖尿病的物质，其致病原因在于它能破坏 小鼠的胰岛细胞导致氧化应激而升高血糖，通过对大鼠进行腹腔注射ALX，对大 鼠胰岛细胞进行特殊的破坏，从而减少胰岛素的来源使大鼠血糖升高，小鼠进食 量、饮水量、尿量显著增加，体形明显消瘦，行动迟缓，说明ALX 诱导糖尿病 模型成功，无花果多糖对造模成功后糖尿病大鼠血糖的作用见表7.与正常组大鼠 相比，各组大鼠血糖均明显升高，有极显著差异(P0.01).连续灌胃给药后，二甲 双胍组大鼠血糖在不同时期均明显降低，与ALX模型组相比差异极显著(P0.01). 无花果多糖中剂量组大鼠的血糖值与模型组相比差异显著(P0.05)，而高剂量组与 模型组比较血糖明显降低，差异极显著(P0.01).结果表明无花果多糖对糖尿病模 型大鼠具有明显的降血糖作用，而且这种降血糖作用以高剂量组效果最好，与二甲双胍组的降糖效果相仿无显著差异(P0.05). 2.8 无花果多糖对糖尿病大鼠糖化血红蛋白的影响 糖化血红蛋白是人体血液中HbAlc与葡萄糖通过非酶促的缓慢结合所形 成的一种血红蛋白组分，与血糖浓度成正比，所以检测血中HbAlc水平可以直观 地反映出血糖水平，能更好地反映机体糖代谢的情况.无花果多糖对糖尿病大鼠 糖化血红蛋白的作用见表8.无花果多糖高、中剂量组大鼠糖化血红蛋白含量显著 下降，与模型组比较具有显著性差异(P0.05和P0.01)，低剂量组大鼠糖化血红蛋 白含量与模型组比较无显著性差异(P 0.05).说明无花果多糖能够降低糖尿病大鼠 HbAlc水平，其高剂量效果与二甲双胍组相当(P0.05).这也说明多糖能刺激ALX致 糖尿病大鼠的胰岛细胞的再生并释放胰岛素，使胰岛素分泌增多，降低糖尿病大 鼠HbAlc水平，有效调节和改善糖代谢水平，降低大鼠血清葡萄糖水平. 2.9 无花果多糖对糖尿病模型大鼠血脂代谢的影响 无花果多糖对糖尿病大鼠血脂代谢的结果见表9.与正常组相比，糖尿病模 型大鼠TC、TG 和HDL均显著升高(P0.05)，而LDL 显著降低(P0.05).给药4周后， 模型组与二甲双胍组比较，TC、TG 、LDL和HDL均有明显升高(P0.05).无花果 多糖高剂量组与糖尿病模型组比较大鼠的TC、TG 和HDL，有极显著性差异 (P0.01)，其对糖尿病模型大鼠血脂的调节作用与二甲双胍组相当，两组的TC、 TG、HDL 及LDL 含量均无显著性差异(P0.05).结果表明无花果多糖可以调节糖 尿病大鼠血脂. 2.10 无花果多糖对大鼠急性毒理试验 大鼠急性毒性试验半数致死量(LD50)未能测出，一次性灌胃给药约等于6 000mg/kg bw无花果多糖，观察28d，大鼠给药后外观毛色光亮，无兴奋、不安、 窜动、跳跃、竖毛、流泪、流涎、凸眼、扭体反应现象，给药后摄食、进水、大 小便等均无明显异常.观察期间未出现死亡和异常反应，大鼠活动自如.并对大鼠 进行颈椎脱臼处死，然后进行心、肝、肺、脾、肾、子宫、睾丸、卵巢、肠等重 要脏器病理检查，均未出现出血、充血、水肿、渗出、溃疡、穿孔、胸腔、腹腔、 心包膜无积液等明显病理变化，结果说明无花果多糖是一种无毒物质. 3 讨论与结论 通过酶法和响应面法联用，对无花果主要活性成分多糖进行提取工艺优化研究，在提取研究过程中，发现酶解时间是一个动态变化的过程，很难确定最佳 时间，但是在酶解24h后多糖产率达到稳定，所以将酶解时间确定为24h.通过响 应面分析结果确定了无花果多糖的提取最优工艺参数为：酶解温度50.36℃，酶 用量0.06g和pH4.73，该条件下无花果多糖提取预测值为34.47%，验证值为34.13%. 目前提取无花果多糖的方法有很多种，传统提取方法主要是水提法，操作繁琐时 间长而且提取率相对较低.酶解法条件温和，操作简单，节约原材料，有较高的 提取率.无花果多糖提取过程中会因为一些杂质类成分如淀粉、蛋白质、果胶等 而影响提取液的质量，而适当的酶通过温和的酶解反应可将液体中杂质除去，从 而提高体系澄清度.单独用复合酶法提取无花果多糖提取率相对较高，但其耗时 较长，而且酶解法中温度和pH 值都是影响酶解产物的重要因素，它们不但影响 酶的稳定性，而且还影响酶的活性中心必需基团的解离状态和底物的解离状态. 在最适pH 值和温度范围内，底物才能与酶充分的结合，产生大量的产物.所以用 响应面法和酶解法联用优化无花果多糖的提取工艺时，将温度和pH 值设计到最 佳条件，改变了以往提取时无花果资源的严重浪费，对无花果的资源开发和利用 具有重要的现实意义. 本试验研究无花果多糖对四氧嘧啶诱导糖尿病大鼠血糖和血脂的影响.以 腹腔注射ALX建立大鼠糖尿病模型，连续灌胃给药28d，研究HAP对糖尿病大鼠 空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbAlc)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度 脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDLC_訽: M_)等指标的影响.研究表明，大鼠进食 量、饮水量、尿量显著增加，体形明显消瘦，行动迟缓，符合糖尿病三多一少的 症状，且胰岛细胞破损明显，导致糖尿病模型组大鼠的FBG明显高于正常对照组;
经过28d的灌胃治疗，无花果多糖治疗组不同程度地降低了大鼠的FBG，高剂量 治疗组的降糖效果显著;无花果多糖处理降低了大鼠HbA1c含量，作用效果与二 甲双胍组接近;与正常组相比，糖尿病模型组大鼠TC 和TG 浓度显著升高，HDL 的含量有所下降，与糖尿病模型组相比，无花果多糖各剂量组均能使糖尿病大鼠 血清中TG、TC含量降低，同时提高HDL含量，说明能够改善糖尿病大鼠血脂代 谢紊乱的情况;无花果多糖高剂量治疗后主动脉内膜相比模型组较完整平坦，内 皮黏附及浸润于内膜的单核细胞明显较少，内膜增厚明显轻于模型组，说明无花 果多糖可以调节降低糖尿病大鼠血脂，对糖尿病大鼠的血管并发症有一定的改善 作用，对治疗高脂血症、预防动脉粥样硬化、冠心病等方面具有广阔的开发前景， 有望成为一种新型调节血脂的保健食品.本研究中一次性灌服无花果多糖最大剂 量为5 000mg/kg bw，远远大于毒理学评价标准，大鼠急性毒性试验半数致死量 (LD50)未能测出，大鼠给药观察28d后，未出现死亡和异常反应，大鼠活动自如， 说明无花果多糖对大鼠安全无毒.虽然无花果多糖的降血糖作用不如口服降血糖药二甲双胍那么强，但其作用比较温和，不会出现二甲双胍那样强烈的低血糖反 应也是其突出的优点，用来开发无毒无副作用的降糖替代药物具有重要意义.