谈补阳还五汤对脑缺血大鼠神经功能及细胞形态的影响
谈补阳还五汤对脑缺血大鼠神经功能及细胞形态的影响 脑缺血属中风范畴，是临床常见病，具有高发病率、高死亡率及高致残率 的特点，严重危害着人类健康。迄今为止，国内外在治疗脑缺血及其后遗症方面 还缺少有效的化学治疗药物。循证医学表明，中医药对缺血性脑卒中的治疗有一 定优势。当前大量研究集中在中药对急性脑缺血损伤的保护作用。而脑缺血后的 功能恢复是一个较长时间过程，目前对其进行较长时间观察的研究较少。出自清 代王清任《医林改错》的补阳还五汤，是治疗缺血性中风及中风后遗症的经典名 方，该方在临床上应用广泛且疗效确切，但其促神经功能恢复机制还需进一步阐 明。本文采用大脑中动脉线栓法复制大鼠局灶性脑缺血模型，探讨了补阳还五汤 较长时间多时间点对其神经功能的保护作用，以期为治疗缺血性脑中风临床用药 提供实验依据。1 材料 1. 1 动物健康雄性SD 大鼠189 只，SPF 级，体重260 ～ 280 g，购自湖 南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号SCXK( 湘) 2009-0004，动物合 格证号004535。
1. 2 药物补阳还五汤处方来源于清王清任《医林改错》，按原方组成: 黄 芪120 g，赤芍4. 5 g，川芎3 g，归尾6 g，干地龙3 g，红花3 g，桃仁3 g，药材经 湖南中医药研究院鉴定均符合《中国药典》2005 年版标准。补阳还五汤药剂制 备: 饮片先用清水浸泡30 min，第一煎加药材及5 倍体积双蒸水，煎煮60min， 二煎5 倍体积双蒸水，煎煮60 min，两煎混匀，浓缩至含生药2 gmL - 1，冷藏待 用。
1. 3 试剂10% 水合氯醛( 扬州市奥鑫助剂厂) ，多聚甲醛( 长沙市锦华化 工有限公司) ，TTC( 红四氮唑，Sigma 公司) 。
1. 4 仪器Bx51 光学显微镜及IPP5. 1 图像分析系统( 日本Olympus) ，FA 型电子天平( 上海台之衡电子衡器有限公司) ，自动双重纯水蒸馏器( 上海玻璃 仪器一厂) ，Finesse 325 型石蜡切片机( 英国Shando) 。
2 方法 2. 1 分组与给药将大鼠随机分为假手术组、模型组和补阳还五汤组，每组63 只，每组动物又分3 个时间点，即分别于首次给药后7， 14， 21 d 处死， 每个时间点21 只动物。补阳还五汤组动物于术后2 h后开始给药，给药剂量为5 gkg - 1d - 1，每日ig 1次。模型组和假手术组动物均给予等体积蒸馏水。
2. 2 模型制备与评价参照文献采用大脑中动脉线栓法复制大鼠局灶性脑 缺血模型: 10% 水合氯醛( 3. 5 mLkg - 1 ) ip 麻醉，取颈正中切口长约3cm，逐层 分离，结扎颈外动脉，夹闭颈内动脉、再结扎颈总动脉，于颈总动脉充盈分叉部 下方约4 mm处将一长为4 cm 直径为0. 26 mm 的尼龙鱼线插入颈内动脉，直到遇 到轻微阻力为止，固定尼龙线，缝合切口。假手术组仅切开皮肤、分离左侧颈总 动脉后随即缝合。术后将动物置于放有清洁垫料的饲养盒内，自由饮水、进食。
动物清醒2 h 后参照Longa及Bederson的5 分制法进行神经功能评分，分值在1 ～ 3 分者入组。0 分: 无神经损伤症状;
1 分: 不能完全伸展对侧前爪;
2 分: 向对 侧转圈;
3 分: 向对侧倾倒;
4 分: 不能自发行走，意识丧失。评分越高，神经功 能缺损越严重，反之亦然。不纳入标准: 评分低于1 分;
蛛网膜下腔出血;
HE 染 色无脑缺血病理改变;
未到时间点死亡。死亡等不足动物时随机替补。
2. 3 指标检测 2. 3. 1 TTC 染色测脑梗死面积比每组每个时间点5 只大鼠， 10% 水合氯 醛麻醉后，断头取大脑，置于- 20 ℃ 冷冻20 min 后，自额极每隔2 mm 切1片。
第1 刀在脑前极与视交叉连线中点处;
第2 刀在视交叉部位;
第3 刀在漏斗柄部 位;
第4 刀在漏斗柄与后叶尾极之间，共A，B，C，D，E 5 片。用2%的红四氮 唑染色，37 ℃下避光30 min，正常组织呈深红色，而梗死组织则为白色。拍照 后选最大缺血断面C 片梗死面积，运用Image-Pro Express 图像分析系统扫描计 算，取梗死面积占C 片大脑总面积的百分比表示。为消除梗死侧大脑半球因脑 水肿造成的误差，按Swanson 方法进行校正后计算C 片梗死面积百分比( IS) 。
IS = ( S1 - Sr) /2S1 100%S1: C 片健侧总面积;
Sr: C 片患侧非梗死区面积。
2. 3. 2 神经功能评分每组每个时间点10 只大鼠，于术后2 h 及动物处死 前1 h 进行神经功能评分。
2. 3. 3 HE 染色观察海马、皮质组织病理学变化每组每个时间点6 只。同 2. 3. 1 取大脑后4% 多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋，脑冠状 连续切片( 片厚5 m) ，取含海马切片贴于载玻片上，随后HE 染色，光镜下观察 比较各组大鼠左侧海马、皮质组织细胞形态病理学改变。2. 4 统计学分析 所有数据以珋x s 表示，应用SPSS 19. 0 统计软件对数据进行统计分析， 组间比较用单因素方差分析，P 0. 05 被认为具有统计学意义。
3 结果 3. 1 各组脑梗死面积比较通过TTC 染色，假手术组着色比较均匀，为深 红色;
7， 14， 21 d 模型组与补阳还五汤组染色不均匀，局部梗死区为白色， 梗死部位在缺血侧顶叶大脑皮质、海马周围。梗死面积分析显示，模型组和补阳 还五汤组随时间点后延脑梗死面积均逐渐缩小( P 0. 05) ;
且7， 14， 21 d 补阳 还五汤组梗死面积明显小于同时相模型组，差异具有统计学意义( P 0. 05) 。
3. 2 各组神经功能评分情况假手术组各时间点大鼠神经功能评分均为0 分;
补阳还五汤组各时间点神经功能评分均较同时相模型组低，差异具有统计学 意义( P 0. 05) 。
3. 3 各组海马、皮质组织细胞形态学变化 3. 3. 1 海马假手术组海马细胞形态正常，细胞轮廓清晰可见，细胞核染色 均匀，细胞排列整齐，间质着色均匀。7，14，21 d 模型组海马神经细胞皱缩， 出现细胞核固缩，核边集严重，细胞内有空泡，细胞形态由椭圆形变成梭形、三 角形，细胞间间距增大，间质染色稀疏，有空洞。7， 14， 21 d 补阳还五汤组 海马细胞空泡样细胞较模型组明显减少，细胞形态明显改善，细胞排列较模型组 整齐。7，14 d 补阳还五汤组仍存在少量核深染及空泡样改变细胞，但21 d 补阳 还五汤组海马细胞形态接近假手术组。
3. 3. 2 皮质假手术组皮质细胞形态正常，边缘清晰，排列整齐，形态完整， 胞核着色均匀，细胞间质染色均匀。7，14，21 d 模型组缺血细胞呈空泡样坏死， 细胞形态丧失，细胞间间隙增大，染色变浅，呈网状改变;
残存细胞其体积缩小、 细胞核固缩深染、细胞边界不清。补阳还五汤组各时间点皮质细胞空泡样细胞较 同时间相模型组明显减少，细胞形态明显改善，细胞排列整齐，神经细胞核较清 晰，细胞间隙染色较均匀。
4 讨论 局灶性脑缺血又称缺血性脑卒中，是由于脑的血液供应障碍，导致脑组织缺血、缺氧，所致相应区域脑梗死性坏死，大量神经元丧失，而产生相应的神经 功能缺损症状与体征，是脑血管疾病中最为常见的临床类型。目前西医治疗脑缺 血的主要方法包括溶栓、抗凝、降纤、扩血管、高压氧、介入治疗等，还有尚处 于动物实验阶段的基因治疗、神经干细胞移植等。这些治疗方法中除了超早期 ( 发病3 h 内)溶栓治疗有效率高达21% ～ 93%，其他疗法效果并不确定。而且 溶栓治疗因其严格的时间窗，意味着只有不到5% 的病人有机会进行这一治疗。
因此，缺血性脑中风的病人约80% 留下不同程度的后遗症神经功能缺损。
典型的缺血性脑卒中在临床上可按照病程分为3 期。第1 期急性期，脑卒 中后1 个月内;
第2 期恢复期，脑卒中后2 ～ 6 个月内;
第3 期后遗症期，脑卒 中6 个月后。补阳还五汤主要用于脑缺血恢复期及后遗症期治疗，是治疗脑缺血 后遗症的首选方，临床应用疗效显著。因此在动物实验中我们观察的时间点最长 达到缺血后21 d，这相当于人脑缺血后遗症期。本实验研究中，神经功能评分结 果表明补阳还五汤能促进脑缺血后大鼠神经功能恢复。其作用机制有学者认为与 促血管生成、扩血管、抗凝、溶栓等改善脑缺血局部微循环，减轻脑水肿及氧自 由基损伤，保护脑组织，从而促进神经功能恢复。本实验室及国内其他实验室研 究表明补阳还五汤能促进缺血后脑内神经干细胞增殖、迁移、分化，可能也是其 促进缺血后神经功能恢复机制之一。通过比较各组动物脑梗死面积比，结果显示 补阳还五汤各时间点分别较同时间相模型组脑梗死面积明显缩小。可能的原因 有: 其一，补阳还五汤在脑缺血急性期起脑保护作用，抑制了大量神经元死亡与 凋亡导致梗死面积变小;
其二，补阳还五汤促进缺血后脑组织再生、修复、代偿， 而导致梗死面积较相应的模型组缩小;
二者也可能兼而有之。另外，通过比较补 阳还五汤组与模型组缺血后海马、皮质组织学改变，结果表明补阳还五汤能明显 改善细胞形态与排列，促进脑缺血损伤后组织修复。
总之，本研究证实了补阳还五汤具有降低脑缺血神经功能评分、减小脑梗 死面积、改善脑组织细胞形态与排列的脑保护作用，为该药临床治疗缺血性脑卒 中提供了有力的实验依据。