谈小剂量辣椒素对大鼠内脏机械及化学刺激敏感性的影响
谈小剂量辣椒素对大鼠内脏机械及化学刺激敏感性的影响 近年来，功能性胃肠病(functional gastrointestinaldisorders， FGIDs) 的发 病率正逐年上升， 但其发病机制仍不清楚， 大量研究显示内脏高敏感在FGIDs 发病机制中有着关键作用。随着辣椒素(capsaicin， Cap) 缓解疼痛的作用被逐渐 认识，Cap 对FGIDs 内脏高敏感的研究越来越多。一些学者研究发现初次或短 期使用Cap， 并不能立刻发挥镇痛作用， 相反， 还会引发或加重疼痛。随着使 用时间的延长， Cap 才能逐渐展示其镇痛效果[1]。Cap通过刺激初级传入神经 元末梢和细胞膜上的特殊受体而产生作用， 此受体称为辣椒素受体(TRPV1)。Cap 可通过激活消化道内TRPV1 的表达而影响内脏的高敏感性， 但Cap、 TRPV1 和内脏高敏感的相互作用目前还不完全清楚。因此本研究通过喂食大鼠 Cap 饲料， 研究连续摄入小剂量Cap 在不同时间点对不同性别大鼠内脏化学和 机械刺激敏感性的影响。
材料与方法 实验动物清洁级SD 大鼠160 只， 雌雄各80 只，体重180 ~ 200 g， 饲养 2 周以适应环境。药品与试剂Cap (99%浓度， 美国Sigma 公司);10FR 导尿管;
动物用新斯的明注射液;
兔抗大鼠TRPV1 多克隆抗体;
二步法免疫组化检测试 剂(PV- 6001);
DAB 显色试剂盒等。Cap 饲料的配制每日新鲜配制， 99% Cap 1 mg，加入到普通饲料粉100 g， 充分混匀成形， 即得到Cap 浓度为10 mgkg-1 的 Cap 饲料。实验分组及分期SD 大鼠160 只， 随机分为对照组与观察组， 每组 80 只， 雌雄各半。对照组摄入普通饲料;
观察组摄入Cap 饲料， 剂量为Cap1 mgkg-1d-1。每组再随机均分为5 小组， 分别观察给予Cap 后1 d、3 d、1 周、2 周和4 周的改变， 对应观察时间， 每小组大鼠16 只， 雌雄各半。内脏机械刺 激敏感性测定采用直肠气囊扩张法。诱导大鼠排尽直肠内粪便， 石蜡油涂抹肛 周，10FR 导尿管气囊端置入大鼠直肠， 胶布固定于尾部， 采用5 mL 空针向 气囊内匀速注气， 边注气边观察腹痛相关行为即大鼠腹部撤离反射行为 (abdominal withdrawal reflex， AWR)， 当大鼠行为达到AWR 评分的4 分， 结 束注气， 记录气囊内注入的空气体积即气囊扩张的体积。AWR 行为评分标准：
(1) 在给予刺激时， 大鼠情绪基本稳定，评为0 分;
(2) 在给予刺激时大鼠变得 不稳定，偶尔扭动头部， 评为1 分;
(3) 大鼠腹背部肌肉轻微收缩但腹部并未抬 离地面， 评为2 分;
(4)大鼠腹背部肌肉较强收缩并把腹部抬离地面， 评为3 分;
(5) 大鼠腹部肌肉强烈收缩， 背部成弓形并把腹部、骨盆及会阴部抬离地面， 评 为4 分。内脏化学刺激敏感性测定采用腹腔注射新斯的明方法。大鼠空腹状态，用1 mL 注射器向腹腔内注射新斯的明注射液， 浓度为60 gmL-1， 剂量为120 gkg-1。注射完毕放入0.5 m2 干净饲养箱，立即计时， 观察大鼠行为变化， 记 录到大鼠开始出现AWR 评分 3 分时的时间， 为化学刺激开始时间;
从化学刺 激开始时间到大鼠行为首次恢复AWR 评分 3 分时间， 为化学刺激持续的时间。
免疫组化法观察胃、十二指肠组织TRPV1 的表达取大鼠胃、十二指肠组织各一 块， 固定包埋，采用二步法免疫组化染色检测TRPV1 的表达， 严格按照试剂 盒说明行免疫组化染色。采用彩色病理图像分析软件分析， 计算阳性指数(PI)， PI =阳性信号面积平均吸光度值 测定面积， PI 值越大， 表示TRPV1 释放越 多。统计学处理结果采用SPSS 19.0 统计软件分析，计量资料以x s 表示， 各组 数据先进行独立性、正态分布及方差齐性检测， 多组样本均数之间比较当方差 齐时采用双因素方差分析， 方差不齐时采用秩和检验。检验水准 = 0.05， P 0.05 为有显著意义。
结果 一般情况所有大鼠精神状态良好， 行动灵活，食欲佳， 皮毛光滑， 大 小便正常。Cap 对大鼠内脏机械刺激敏感性的影响与对照组相比较， 喂食Cap 1 周， 观察组大鼠气囊扩张体积显著减少(P = 0.002)， 且雌性较雄性对气囊扩张 实验更敏感(P = 0.001);
相反， 喂食Cap 4 周，观察组大鼠气囊扩张体积显著增 加(P = 0.007);而喂食1 d、3 d、2 周观察组与对照组之间差异无显著意义(P 0.05)， 见表1。喂食Cap 饲料， 大鼠对内脏机械刺激敏感性的变化呈先增加后降低的趋 势， 并以2 周时间为分界。
Cap 对大鼠内脏化学刺激敏感性的影响与对照组相比较， 喂食Cap 1 周， 观察组大鼠腹痛相关行为的持续时间显著延长(P = 0.001)， 而喂食Cap4 周， 观 察组大鼠腹痛相关行为的开始时间显著延长(P = 0.02) ;
其余各组之间差异无显 著意义(P 0.05)，。胃、十二指肠TRPV1 表达情况TRPV1 免疫阳性产物在大鼠 胃、十二指肠组织均有表达， 呈棕黄色或黄色颗粒。与对照组比较， 给予Cap 1 d、3 d、1 周后， 观察组TRPV1 表达显著高于对照组(均P 2、4 周后， 观察组 与对照组之间差异无显著意义(P 十二指肠组织TRPV1 的PI 值：
与对照组比较， 给予Cap 1 d、3 d 后， 观察组显著高于对照组(均P 1、2、4 周后， 观察组与对 照组之间差异无显著意义(P 0.05)。
讨论 Cap 是从辣椒中提取的主要辛辣成分之一， 化学名为反8- 甲基- N- 香草基- 6- 壬烯基酰胺。研究发现辣椒中富含的Cap 除了能促进胃内黏液分泌，增加 黏膜血供来保护胃黏膜， 还可能促进胃肠蠕动， 调节内脏高敏感， 甚至抑制 消化道肿瘤发生。Cap 有刺激兴奋、感觉阻滞、长时程选择性神经毒性损害和不 可逆性细胞破坏四种药理效应， 它的最终效应取决于给药的剂量和时间。初次 或小剂量( 10 mgkg-1) 的Cap 作用于CAP 敏感传入神经(CSANs)， 可使该神经 纤维产生一时性的兴奋，释放某些神经递质， 向上级神经元传递信号， 称为刺 激兴奋;
当继续或反复使用Cap， 可使兴奋的CSANs 耗竭大量的神经递质而对 刺激无反应， 出现脱敏 现象， 又称为Cap 的感觉阻滞作用;大剂量的Cap 在引 起原初级刺激兴奋作用后， 可引起神经递质的过量释放， 导致CSANs 受到严 重损害， 失去其信息传入功能， 此为Cap 选择性神经毒性损害， 甚至不可逆 性细胞破坏， 亦称为Cap的化学去神经 作用。关于辣椒素的剂量，研究认为小 剂量( 10 mgkg-1) 的Cap 可引起刺激兴奋;
大剂量( 50 mgkg-1) 的Cap 可使 CSANs 产生化学 去神经 作用 ;
中等剂量(10 ~ 50 mgkg-1) Cap 可能会使兴奋 的CSANs 产生感觉阻滞作用。本研究选用1 mgkg-1d-1 Cap，即小剂量Cap 进行 实验。
Cap 既可致痛又可止痛， 初次应用Cap， 可产生烧灼样的疼痛感。CAO 等观察42 例健康志愿者服用Cap 胶囊后， 2 ~ 3 d 时间内有38 例出现了上腹疼 痛， 其中部分志愿者15 min 即出现症状;但随着给药时间延长， 逐渐出现止痛 的效果，BORTOLOTTI 等肠道功能性消化不良(FD) 患者连续3 周摄入0.35 mg 剂量的Cap 胶囊腹痛症状有所改善， FUHRER 等研究发现肠易激综合征(IBS) 患者连续服用Cap 胶囊4 周后， 其对不良化学刺激耐受性显著提高。大量研究 证实FD 及IBS 患者具有内脏高敏感性， 表现为胃和直肠对机械或化学刺激疼 痛阈值降低， TACK 等的研究显示约有34%的FD 患者存在内脏高敏感。如果 应用Cap 缓解内脏高敏感， 需渡过其短期致痛效应， 延长Cap 的应用时间至 关重要。也就是说， 若要开发Cap 作为镇痛药物治疗慢性腹痛症状， 疗程可能 较普通药物更长。本实验将内脏刺激分为机械刺激和化学刺激， 结果显示， 摄 入Cap 1 周大鼠机械和化学刺激敏感性显著增加， 2 周敏感性均下降， 和正常 水平相当， 而到4 周时敏感性显著降低。另外， 在本实验中出现了机械刺激敏 感性的性别差异， 摄食Cap 饲料1 周， 雌性大鼠敏感性显著高于雄性大鼠， 推 测可能与雌激素抑制结肠平滑肌的收缩活动， 延缓胃肠转运有关。
TRPV1 被称为瞬时感受器电位通道， 广泛分布于脊髓背根神经节、三叉 神经节、自主神经节的中、小神经元上， 以及胃肠道、食管黏膜、黏膜下层、 平滑肌层以及血管周围。大量研究显示， 在FD 及IBS 患者中， 腹痛症状与TRPV1 的表达可能有一定的相关性。TRPV1 敲除降低了胃食管、空肠和结肠传 入神经在扩张刺激下的机械敏感性。陈晓敏等对IBS 患者腹痛症状进行评估， 同 时检测直肠、乙状结肠交界处组织TRPV1的表达情况， 结果发现IBS 患者结肠 组织TRPV1表达显著高于对照组， 且与腹痛程度呈正相关。目前认为， Cap 通 过激活TRPV1 在内脏高敏感中发挥重要作用。短期或初次应用Cap， 可通过激 活TRPV1， 促进神经元内神经递质释放， 引起局部疼痛、烧灼样感觉， 连续 刺激递质将被耗竭， 神经元不再敏感， 疼痛刺激将不再起效。本实验显示，喂 食辣椒饲料1 d、3 d、1 周大鼠胃组织TRPV1表达显著升高， 2 周和4 周时下降 至正常水平。大鼠内脏机械和化学刺激敏感性的改变， 可能与TRPV1 的表达水 平相关。短期内摄入Cap 使TRPV1 的表达上调， 增加了内脏对机械及化学刺 激的敏感性;
持续应用Cap， 机体逐渐适应， TRPV1的表达也随之下降， 因而 敏感性也随之降低。综上所述， 连续摄入小剂量Cap 1 周， 大鼠对内脏机械或 化学刺激的敏感性显著增加， 其中雌性对内脏机械刺激较雄性更为敏感， 连续 2 周敏感性逐渐恢复至正常， 连续4 周敏感性显著降低，且大鼠胃、十二指肠 黏膜屏障均无明显影响。四川是辣椒的产地之一， 辣椒素原料丰富原料价格便 宜， Cap 能否作为治疗内脏高敏感患者的新药及其口服剂量和治疗疗程， 有待 进一步研究。