谈不同比例士的宁对马钱子碱体外经皮渗透性质的影响
谈不同比例士的宁对马钱子碱体外经皮渗透性质的影响 马钱子又名番木鳖，为马钱科马钱属植物马钱(Strychnosnux-vomica L.)或 云南马钱(S.pierriana A.W. Hill)的干燥成熟种子，主要有效成分为生物碱类。包 括士的宁、马钱子碱、士的宁氮氧化物、马钱子碱氮氧化物、异马钱子碱、伪马 钱子碱等，约占总量1%-5%。其中士的宁和马钱子碱约占总生物碱的70%。马钱 子生物碱作用于免疫、神经、心血管等系统，具有抗炎及免疫、镇痛、抗肿瘤等 显著疗效。主要有效成分马钱子碱具有很强的抗炎镇痛和关节炎滑膜细胞增殖抑 制作用，而士的宁在抗炎镇痛方面活性较差，且毒性较强，其口服中毒量是马钱 子碱的1/71。因此马钱子制剂中士的宁的含量会直接影响制剂的药效及毒性。研究表明，马钱子制成经皮给药制剂对风湿痹症等具有较好疗效，但其毒 性，尤其是士的宁是亟待解决的问题之一。为达到治疗的增效减毒，本实验利用 体外经皮扩散方法，探讨士的宁与马钱子碱在不同比例下，马钱子碱的经皮扩散 行为，为马钱子的炮制及其经皮制剂的研究等应用方面提供参考依据。
材料 1. 动物 清洁级雄性ICR小鼠30只，体质量(20.03.0)g，浙江省实验动物中心提供， 合格证号：SCXK(浙)2008-0033。
2. 仪器 1200 Agilent高效液相色谱(美国Agilent公司);RYJ-12B药物透皮扩散试验 仪(上海黄海药检仪器有限公司);XS205电子微量天平(瑞士Mettler Toledo公 司);STARTER2100酸度计(美国OHAUS公司)。
3. 试药 马钱子碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110706-200505，纯度 95.9%);士的宁对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110705-200306，纯度 97%);马钱子碱纯品(南京泽朗植提技术有限公司，批号：ZL110116，纯度97.2%);
士的宁纯品(南京泽朗植提技术有限公司，批号：ZL110120，纯度96.2%);马钱子 购于杭州华东中药饮片有限公司，批号：101011，经该公司质检科郑霄鹰主管药 师鉴定为马钱科植物马钱子(Strychnos nux-vomica.L.)的干燥成熟种子;马钱子总生物碱提取物1(自制，批号：20120608，马钱子碱含量94.1%);马钱子总生物碱提 取物2(自制，批号：20120828，马钱子碱含量27.01%，士的宁含量2 6 .95%，总 生物碱含量67.38%)。乙腈(美国Tedia公司，批号：14035045，色谱纯);其他试剂 均为分析纯。
方法 1. 透皮接受液中马钱子碱、士的宁的含量测定方法研究 1.1 色谱条件 色谱柱：Agilent SB-C18柱(4.6mm150mm，5流动相：乙腈-0.01moL/L庚烷 磺酸钠与0.02moL/L磷酸二氢钾等量混合(10%磷酸调pH值为2.80)(21∶79);流 速：1.0mL/min;检测波长：260nm;进样量：20柱温：室温。
1.2 对照品溶液的制备 精密称量马钱子碱、士的宁对照品适量，甲醇溶解，流动相稀释至浓度分 别为38.80、45.20g/mL。
1.3 供试品溶液的制备 取透皮接受液，0.45m微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
1.4 标准曲线 取1.2项下对照品溶液，分别进样5、10、15、20、30、40、50、60L，在 上述色谱条件下进行检测。相应对照品峰面积(Y)为纵坐标，进样量(X)为横坐标 进行线性回归，得到马钱子碱回归方程Y=1 767.7X-39 093，r=0.9999，马钱子碱 在0.194-2.328g内线性关系良好。得到士的宁回归方程Y=2 352.3X-2 9943， r=0.9929，士的宁在0.226-2.712g内线性关系良好。
1.5 仪器精密度试验 精密吸取对照品溶液，连续进样6次，计算峰面积的RSD值分别为0.19%， 0.18%，说明仪器精密度良好。
1.6 重复性试验平行制备供试品溶液6份，进样检测，计算马钱子碱和士的宁的RSD值均 为0.32%。说明此方法的重复性良好。
1.7 加样回收率试验 精密量取已知含量马钱子碱18.79g/mL，士的宁3.57g /mL的上述供试品溶 液6份，每份0.5mL，各加0.2mL混合对照品溶液，流动相定容至2mL，在上述色 谱条件下进行检测，计算回收率，结果见表1。测得马钱子碱和士的宁的平均回 收率为96.74%，99.28%，RSD值分别为0.99%，0.55%(n=6)。说明此方法准确度 良好。
1.8 样品溶液稳定性试验 取上述供试品溶液置于37℃条件下(n=6)，24h后测定含量，马钱子碱、士 的宁的RSD值分别为1.17%和1.52%，表明在37℃条件下透皮接受液中马钱子碱和 士的宁在24h内稳定性良好。
2. 体外经皮吸收实验 2.1 接受介质的配制 称取氯化钠8.00g，氯化钾0.20g，磷酸氢二钠3.63g，磷酸二氢钾0.2 4g， 加蒸馏水溶解定容至1 0 0 0mL，即得pH值7.40磷酸盐缓冲液(PBS)。量取80 0mLPBS加入200mL无水乙醇，混匀，即得20%乙醇的PBS溶液。
2.2 样品溶液的配制 马钱子碱溶液的配制：精密称取马钱子碱纯品适量，接受介质溶解稀释至 浓度为1.56mg/mL。士的宁溶液的配制：精密称取士的宁纯品适量，接受介质溶 解稀释至浓度为0.48mg/mL。马钱子总生物碱提取物1溶液的配制：精密称取马 钱子总生物碱提取物1适量，接受介质溶解稀释至马钱子碱浓度为1.62mg/mL。
马钱子总生物碱提取物2溶液的配制：精密称取马钱子总生物碱提取物适量，接 受介质溶解稀释至马钱子碱浓度为0.829mg/mL，士的宁浓度为0.797mg/mL。按 一定比例吸取上述马钱子碱、士的宁溶液，制得不同比例的纯品组;马钱子总生 物碱提取物1溶液中加入适量马钱子总生物碱提取物2溶液，制得不同比例的提取 物组。2.3 离体皮肤的制备 取雄性健康小鼠，用7%硫化钠溶液(含5%甘油)活体脱去其背部毛发后 0.9%氯化钠溶液洗净皮肤，擦干后饲养12h。处死后剥离背部皮肤，剔除皮下脂 肪和黏连物，0.9%氯化钠溶液洗净，待用。
2.4 离体透皮实验 将小鼠皮肤自然固定在改良的Franz扩散池两室之间，皮肤角质层朝向供 药室，有效扩散面积为2.8cm2，接受室容积为6.5mL。接受室中加入37℃预热的 接受介质，皮肤与接受液间紧密贴合，排尽气泡。供药室中分别加入0.5mL上述 比例的纯品组和提取物组溶液，(37.01.0)℃恒温水浴加热，以600r/min磁力恒速 搅拌。分别于给药后2、4、6、8、10、12、24h取样5mL，并补加5mL 37℃预热 的新鲜接受介质。HPLC法测定马钱子碱，士的宁含量。根据各取样点接受液中 马钱子碱，士的宁含量，计算单位面积药物累积透过量(Q)及稳态渗透速率(J)。
Q计算公式如下：Q=(V0Cn+Vn-1i-1Ci)/A (1)其中Q为单位面积累积透过量(A为有 效透皮吸收面积(cm2);V0为接受液体积(mL);V为取样体积(mL);Ci、Cn为第i(in-1)、 n个取样点测得接受液中药物浓度(g/mL)。并按公式(2)计算累计透过百分率Q%。
Q%=QA/QT (2)其中QT为上样的总药量(g)。
结果 1. 马钱子碱的透皮结果 马钱子碱在纯品组及提取物组中透皮累积渗透曲线。透皮速率及累积透过 百分率。随着士的宁比例的增加，纯品组及提取物中组马钱子碱的J及Q%依次减 小。当比例为1∶0.6，提取物组与纯品组进行比较，Q%明显升高(P0.05)，J增大， 说明可能其他生物碱的存在对马钱子碱的透过有一定的影响。
2 . 士的宁的透皮结果 士的宁在纯品组及提取物组中透皮累积渗透曲线。透皮速率及累积透过百 分率。
讨论 本研究发现：随着士的宁比例的增大，士的宁的J与Q%逐渐升高，而马钱 子碱的J与Q%随之降低。说明提取物或混合物中士的宁均可抑制马钱子碱的透皮吸收性能，且随着士的宁比例的增大抑制效果增强，这与胡巍等[13]报道的结果 有所出入。由马钱子碱和士的宁的结构式可知：其结构和物理化学性质相似，透 皮吸收时产生同质竞争抑制是有可能的。但是，不同实验动物乃至人体皮肤的实 验结果是否也类似，以及具体机制等均需通过进一步实验研究加以确证。此外， 研究结果还表明：马钱子总生物碱提取物中其他生物碱等能够促进士的宁的透皮 吸收。由此证明，马钱子生物碱用于类风湿关节炎治疗时，尽可能降低士的宁的 含量，对增效减毒具有重要意义。马钱子治疗类风湿性关节炎效果显著，但由于 毒性较强极大限制临床应用。本研究的发现可为马钱子的炮制和经皮给药制剂研 究应用等方面提供依据参考。