从P38-MAPK 信号通路讨论
从P38-MAPK 信号通路讨论 黄芩苷对Ac-LDL+LPS诱导的与动脉粥样硬化相关巨噬细胞凋亡的影响 动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)相关心血管疾病的发生与AS 斑块的不稳定性 密切相关。巨噬细胞是不稳定斑块的主要细胞成分，其凋亡与As斑块的破裂相关。研究发现巨噬细胞凋亡的结果在AS 的早期和晚期是不同的。早期病变中，巨噬 细胞的凋亡有利于抑制病变细胞泡沫化，显著降低早期病变面积。晚期巨噬细胞 凋亡与动脉粥样硬化斑块的破裂密切相关。
p38 蛋白激酶通路是已确定的 MAPKs 家族成员之一，参与细胞的生长、 发育以及细胞间功能同步等多种生理过程，并与炎症、应激反应的调控密切相关。
p38 MAPK通路也参与介导凋亡的信号传导，促进巨噬细胞的凋亡。
黄芩苷(baicalin)是由黄芩的干燥根中提取的一种黄酮类化合物，是黄芩的 主要有效成分之一。近年来，大量研究发现，黄芩苷具有抗动脉粥样硬化作用。
然而对黄芩苷抗AS 的作用机制并没有明确的阐明。通过整体及离体实验研究发 现，黄芩苷对肺炎衣原体感染所致AS 病理过程具有良好的阻抑作用。本实验以 脂多糖和乙酰低密度脂蛋白双重打击诱导离体培养的巨噬细胞凋亡，观察黄芩苷 对凋亡及凋亡相关P38 MAPK信号通路的影响，从巨噬细胞凋亡信号通路方面论 证黄芩苷干预动脉粥样硬化的作用机制。
1 材料与方法 1.1 材料 RAW264.7细胞购自中山医学院细胞中心;0.25% 胰酶、DMEM 培养液、 脂多糖、培养瓶、PBS、胎牛血清、青霉素、链霉素购自广州斯佳生物科技有限 公司;乙酰低密度脂蛋白、脂多糖、黄芩苷、AnnexinV FITC/PI细胞凋亡检测试剂 盒、Westernblot 检测试剂盒购自广州晨展生物公司。
1.2 巨噬细胞的收集及试验分组 RAW264.7细胞株常规培养于含100 g/mL青链霉素、10% 胎牛血清的 RPMI1640 完全培养液，置37 ℃、5% CO2、饱和湿度中培养，所有实验均在细 胞处于对数生长期进行。黄芩苷剂量参照邝氏实验，乙酰低密度脂蛋白用量参照 Venkateswaran A实验，脂多糖用量参照万氏实验，试验分为7组，即为(1)正常组：巨噬细胞采用原培养基孵育;(2)乙酰低密度脂蛋白对照组：原培养基中吸出125 L 上清液，加入100 g/mL Ac-LDL 125 (3)脂多糖对照组：原培养基中吸出50 L 上 清液，加入1 g/mL LPS 50 (4)模型组：原培养基中吸出175L上清液，加入100 g/mL Ac-LDL125g/mL LPS 50(5)低剂量观察组：原培养基中吸出275L 上清液，加入100 g/mLAc-LDL 125L +1 g/mL LPS 50L +120 g/mL黄芩苷含药血清100(6)中剂量观 察组：原培养基中吸出275L 上清液，加入100 g/mL Ac-LDL 125L +1 g/mL LPS 50L +240 g/mL 黄芩苷含药血清100(7)高剂量观察组：原培养基中吸出275L上清 液，加入100 g/mL Ac-LDL125g/mL LPS 50L +480 g/mL黄芩苷含药血清100L。
1.3 AnnexinVFITC/PI细胞凋亡检测 用完全培养液调整细胞数为1.5105 个/mL，接种于24 孔板，待细胞贴壁 后，分组方法同前，刺激物加入24 h 后，用不含EDTA 的胰酶消化细胞，PBS 洗2 次，按试剂盒说明书要求染色后，流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.4 Western-blot检测P38的表达 另取细胞接种于12 孔板，待细胞贴壁后，分组方法同1.2项下，刺激物加 入 4 h 后，加入细胞裂解液，采用Western - blot 法检测P38-MAPK 含量。具体 步骤如下：将细胞收集裂解后进行丙稀酰胺凝胶电泳，电泳后，将胶上的 DNA 转移到 PVDF 膜上，PVDF膜用封闭液封闭之后，TBST 液洗膜 3 次，并分别 加入鼠P38 4 ℃过夜。并用鼠 GAPDH 单抗(一抗)作为内参照。TBST 液再洗膜 3 次后，加入HRP 标记的羊抗鼠二抗室温振荡 2 h，洗膜后，加入LumiGLO 底 物，对X 胶片(Kodak，日本)适度曝光后，显影，定影。
1.5 实时荧光定量PCR技术检测JNK蛋白表达 使用qRT-PCR法，操作步骤按试剂盒说明书完成。
1.6 统计学处理 数据采用SPSS 13.0 统计软件，采用方差分析__(ANOVA)模块，组间比较 采用t 检验。
2 结果 2.1 流式细胞仪检测细胞凋亡正常组、对照组与模型组的凋亡率差异有统计学意义(P 0.01)，模型组细 胞凋亡率明显高于正常组和对照组，可知实验造模成功。黄芩苷低剂量观察组与 模型组细胞凋亡率相比差异无统计学意义(P 0.01)。黄芩苷中、高剂量观察组与 模型组细胞凋亡率相比差异有统计学意义(P 0.01)，黄芩苷中、高剂量观察组细 胞凋亡率明显高于模型组，而高剂量观察组细胞凋亡率又高于中剂量观察组。结 果见表1。以Annexin-FITC和PI(propidium，碘化丙锭)双标法经流式细胞仪检测 RAW264.7 巨噬细胞凋亡率。
2.2 Western-blot检测磷酸化P38的表达 常规培养基孵育的巨噬细胞(正常组)中有少量磷酸化P38 表达，定义为1。
在Ac-LDL、LPS、Ac-LDL+LPS的干预下，磷酸化P38 表达皆升高。乙酰低密度 脂蛋白对照组与脂多糖对照组磷酸化P38 相对表达量为：2.0、1.2，模型组中磷 酸化P38表达明显，为2.2。这表明在Ac-LDL、LPS、Ac-LDL+LPS的干预下磷酸 化P38 表达水平皆增加，Ac-LDL+LPS模型组最明显，证明建模成功。经过黄芩 苷的处理，低、中、高剂量观察组磷酸化P38 表达量分别为1.8、1.6、3.8。可见， Ac-LDL+LPS联合打击较Ac-LDL或LPS单独干预的巨噬细胞中P38 高。黄芩苷低、 中剂量观察组对磷酸化p38表达无明显的促进或抑制作用，高剂量观察组磷酸化 P38 表达量明显增高。
3 讨论 本实验采用乙酰低密度脂蛋白及脂多糖双重打击诱导巨噬细胞凋亡。实验 发现，在LPS复合高脂条件下培养后巨噬细胞凋亡显著增加，正常组、对照组与 模型组的细胞凋亡率差异有统计学意义(P 0.01)，模型组细胞凋亡率明显高于正 常组和对照组，可知实验造模成功。在巨噬细胞凋亡显著增加的同时，模型组也 出现了较高水平磷酸化P38 的表达，这说明脂多糖和乙酰低密度脂蛋白双重打击 是诱导巨噬细胞凋亡的重要原因，P38-MAPK信号通路参与这一过程。黄芩苷高 剂量观察组与模型组细胞凋亡率相比差异有统计学意义(P 0.01)，同时黄芩苷高 剂量组磷酸化P38 表达明显增强，较模型组有统计学意义。可见，高剂量的黄芩 苷可能通过激活P38 通路促进早期AS斑块中巨噬细胞凋亡。黄芩苷中剂量观察 组与模型组细胞凋亡率相比差异有统计学意义，黄芩苷低、中剂量组磷酸化P38 表达较模型组无统计学意义。综上所述，随着黄芩苷浓度的上升，细胞凋亡率升 高。高剂量的黄芩苷可能通过激活P38-MAPK信号通路促进巨噬细胞凋亡，而具 体激活P38MAPK信号通路的最小剂量有待进一步研究。中量黄芩苷组磷酸化P38 表达较模型组无计学意义，但其仍促进巨噬细胞的凋亡，考虑中剂量黄芩苷可能通过JNK、SRA 等其他通路促进细胞凋亡，需进一步研究以阐明。
动脉粥样硬化斑块越不稳定，越易破裂，斑块破裂后易导致血栓形成。而 巨噬细胞是不稳定斑块的主要细胞成分。巨噬细胞凋亡在AS 发生发展中起着非 常重要的作用，它贯穿了AS整个过程。Tracie 等[17-18] 用多种基因敲除动物模 型深入研究了FC 引起巨噬细胞凋亡的机制，发现主要需要3个通路的同时作用， 这3 个通路分别为氨基端激酶(JNK)通路、P38-UPR-CHOP通路和A 型清道夫受 体(SRA)通路。P38 表达与巨噬细胞凋亡有密切联系[19-20]。近年国内外学者以 LPS 和乙酰化低密度脂蛋白(Ac-LDL)加酰基辅酶A- 胆固醇酰基转移酶抑制剂 (58035)条件成功诱导巨噬细胞凋亡。近年来，大量研究也发现，黄芩苷具有抗 动脉粥样硬化作用。然而对黄芩苷抗AS 的作用机制并没有明确的阐明。马珺等 研究显示黄芩苷可以通过调节血脂及抗氧化作用对AS 起到干预作用;于昕等研 究提示黄芩苷可能通过降血脂、改善凝血纤溶系统平衡、下调凝血酶激活纤溶抑 制物(TAFI)水平等途径干预AS 的形成;吴伟等研究证明黄芩苷可以明显降低血 清TNF、IL-6 及IL-10 水平，通过抑制炎症反应从而发挥其对AS 的早期干预作 用;李岩等研究提示黄芩苷可能通过抗炎作用发挥其对AS的干预作用。
在动脉粥样硬化早期的病变中(即坏死核心发展之前)，巨噬细胞凋亡与病 灶大小呈反比关系，巨噬细胞的凋亡有利于抑制病变细胞泡沫化，显著降低早期 病变面积。早期病变巨噬细胞死亡的有益方面已经用缺陷鼠来阐明，AIM-/- 和 LDLR-/- 双敲除鼠表明增加了巨噬细胞的死亡，可显著降低早期病变面积。也有 研究发现，在病变早期[23-24]，巨噬细胞吞噬功能很强，主要针对脂蛋白，也可 有效吞噬清除凋亡细胞，限制活体内动脉粥样硬化病变的大小，而在此过程中巨 噬细胞本身也遭受凋亡细胞所释放的细胞因子的影响而发生凋亡，可见在动脉粥 样硬化病变早期巨噬细胞凋亡是减少病变成分，抑制动脉粥样硬化进展的表现。
根据本实验研究数据，综合当前研究现状，高剂量的黄芩苷可能通过激活 P38 MARK 信号通路促进早期AS 斑块中巨噬细胞凋亡，抑制病变细胞泡沫化， 减少病变成分，降低病变面积从而拮抗早期动脉粥样硬化斑块的病理进程。低剂 量黄芩苷的作用不明显，提示较高浓度的黄芩苷才能激活相关通路，发挥拮抗早 期动脉粥样硬化的作用。随着如血管内超声成像等各种检测技术的日益完善，我 们可以更多的从黄芩苷促进早期AS 斑块巨噬细胞凋亡方面入手，深入研究黄芩 苷的抗动脉粥样硬化作用，利用黄芩苷对动脉粥样硬化中巨噬细胞凋亡进行更有 利的调控，为早期有效干预动脉粥样硬化的进展提供新的治疗靶点。