大蒜素单独及与顺铂联用对人子宫内膜癌Ishikaw
大蒜素单独及与顺铂联用对人子宫内膜癌Ishikaw 【摘要】 目的 研究大蒜素单独及与顺铂联用对人子宫内膜癌ishikawa细 胞的影响。方法 用大蒜素单独及大蒜素+顺铂对人子宫内膜癌ishikawa细胞处理 后，用mtt法测定ishikawa细胞的生长抑制率；流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋 亡率；
免疫组化检测bcl-2表达水平；
trap法测定端粒酶活性的变化。结果 大蒜素 （12.5～50 mg/l）能明显抑制ishikawa细胞的生长，促进ishikawa细胞的凋亡，表 现为g2/m期阻滞；
在诱导细胞凋亡的同时伴随端粒酶活性下调和bcl-2表达水平下 降。且表现为时间和计量依赖性。而大蒜素（12.5～50 mg/l）联合顺铂（1 mg/l） 组较单独使用大蒜素对细胞作用更明显。并表现为时间和计量依赖性。结论 大 蒜素能明显抑制ishikawa细胞的生长，诱导其凋亡，并抑制端粒酶活性，bcl-2参 与了大蒜素诱导ishikawa细胞凋亡过程中端粒酶活性的调控。大蒜素对顺铂有增 敏作用，大蒜素与顺铂联用较单独使用大蒜素对细胞作用更明显，从而为临床减 少化疗药物的应用提供理论依据。
【关键词】 大蒜素；
顺铂；
ishikawa细胞；
凋亡；
端粒酶；
bcl-2 effects of allicin or allicin with cisplatin on growth of endometrial carcinoma in ishikawa cells in vitro jia li-gang,wang hui-lan,tian li.the people’s hospital of hebei,shijiazhuang 050051,china ［abstract］ objective to study the effects of allicin or allicin with cisplatin on human endometrial carcinoma ishikawa cell line.methods human endometrial carcinoma ishikawa cells were treated with allicin or allicin with cisplatin.cell growth rate was determined with mtt assay.flow cytometry was used to examine cell cycle and apoptotic rate of cells.the expression of bcl-2 was measured by immunohistochemical and t by trap assay.results allicin （12.5～50 mg/l） inhibited proliferation in human endometrial carcinoma ishikawa cells in time-dependent and dose-dependent manner.ishikawa cells were arrested at g2/m phase and resulted in apoptosis by allicin.telomerase activity and the expression of bcl-2 was down-regulated after allicin treatment when it induced apoptosis.the effects of allicin group was lower than that of allicin combined with cisplatin（1.0 mg/l） in corresponding concentration and took a manner in time-dependent and dose-dependent.conclusion allicin could inhibit the proliferation and enhance apoptosis in endometrial carcinoma cell line ishikawa in vitro.allicin cooperated with cisplatin at influencing the proliferation of ishikawa cells.the ability of inhibiting the proliferation and enhancing apoptosis in allicin combined with cisplatin（1.0 mg/l） group was stronger than that of allicin group.allicin induced apoptosis has associated with telomerase.bcl-2 was involved in the regulation of telomerase activity.the abilityof it in allicin combined with cisplatin（1.0 mg/l） group was strong than that of allicin group.the mechamisms of allicin combined with cisplatin will provide theoretical basis for endometrial carcinoma treatments with less chemotherapeutic drug. ［key words］ allicin；
cisplatin；
ishikawa cell；
apoptosis；
telomerase；
bcl-2 子宫内膜癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一。WWw.133229.COM对 于那些不能手术或术后复发的子宫内膜癌患者，可给予化疗。然而在化疗过程中， 抗癌药物在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常增殖细胞也有杀伤作用，因而影响化疗 的疗效。而且化疗药物都有较严重的副反应，患者治疗的依从性差，生活质量明 显降低。所以如何使药物对肿瘤细胞最大限度的杀伤，而对正常细胞的毒性减少 到最低的化疗方案成为人们关注的焦点之一。本研究旨在通过细胞培育探讨大蒜 素及与顺铂联用对子宫内膜癌ishikawa细胞生长的影响，从而为临床减少化疗药 物的应用提供充分的依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验对象 高分化子宫内膜腺癌细胞（ishikawa细胞系）：购自美国 atcc细胞库。
1.1.2 药物与试剂 大蒜素为安徽安达产品有限公司惠赠。顺铂为中国齐鲁 制药厂产品。鼠抗人bcl-2单克隆抗体，北京中山生物公司产品。
telomerase-pcr-elisa检测试剂盒为boehringer manheim公司。
1.1.3 主要仪器 芬兰labsystems dragon well scan mn3型酶标仪。流式细胞 仪（beckman coulter epics xlusa）。5% co2无菌恒温培养箱heraeus bb5060/bb16 （上海）。
1.2 方法 1.2.1 细胞培育 人子宫内膜癌ishikawa细胞用rpmi-1 640培养液（含青霉素 浓度为100 iu/ml,链霉素浓度为100 μg/ml,10%胎牛血清，ph值7.2），于37 ℃、5% co2饱和湿度培养箱内松盖培育。
1.2.2 mtt检测 取对数生长的ishikawa细胞，制成浓度为7×104个/ml的细胞 悬液，接种到96孔培养板中，每孔100 μl，贴壁后，换培养液，实验组分为大蒜素组、顺铂组和大蒜素+顺铂组，大蒜素组（由吐温80溶解）分别加入含大蒜素 为12.5、25、50 mg/l的培养液（各组含0.01%吐温80）；
顺铂组加入含顺铂为1.0 mg/l的培养液；
大蒜素+顺铂组加入含各浓度大蒜素和顺铂（1.0 mg/l）的培养液， 对照组为含0.01%吐温80的培养液。每一浓度均设6个平行孔。每个实验均重复3 次。继续培养24、48、72 h后，每孔加入20 μl浓度为5 mg/ml的mtt溶液，继续孵 育4 h。吸净上清液，每孔加入二甲基亚砜200 μl，振荡8～10 min,用酶标光度仪 在波长为492 nm时测定每孔的吸光度（a）值,并计算抑制率，抑制率=（对照组a 值-实验组a值/对照组a值）×100%。
1.2.3 细胞周期和细胞凋亡的检测 将浓度为7×104个/ml接种于100 ml培 养瓶中。贴壁后加入上述大蒜素组和大蒜素+顺铂组培养液。对照组加入含0.01% 吐温80的培养液。继续培养72 h，用胰酶消化后收集细胞，用70%的冷乙醇固定， 用pi（50 μg/ml）1 ml避光染色后,置流式细胞仪（flow cytometer,fcm）分析。
1.2.4 ishikawa细胞端粒酶活性测定 （1）取1×105个ishikawa细胞行裂解、 端粒酶的提取，移取上清液。（2）端粒重复序列扩增反应（trap）：参照说明书。
取20 μg细胞提取物，反应总体积为50 μl。pcr仪行产物扩增；
引物延长，一个循 环；
端粒酶灭活，一个循环；
端粒酶扩增30个循环；
72 ℃平衡10 min,4 ℃保存。
（3）杂交及酶联免疫吸附反应（elisa），30 min内于酶标仪上测定在波长450 nm/690 nm处的吸光度a值，根据δa=a450-a690计算。
1.2.5 ishikawa细胞株bcl-2测定 取浓度为7×104个/ml的ishikawa细胞，以链 霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连接（streptavidin/peroxidase,sp）法测定ishikawa 细胞bcl-2抗体。在6孔板中预先放置盖玻片，将细胞悬液滴在盖玻片上，爬片后 加入各浓度实验组培养液。对照组加入含0.01%吐温80的培养液。结果判定采用 组织化学评分（h-score）法：每一浓度2张玻片，每片至少观察5个视野，阳性染 色为细胞核内出现棕黄色颗粒，以代表染色深浅，共0～3分：0分为不着色;1分 为着色浅，呈浅黄色；
2分为中度着色，呈深黄色；
3分为着色深，呈棕色/咖啡 色。pi代表每一着色程度的细胞所占的比例，为0～100%，h-score=∑pi（i±1）， 满分为4分。
1.3 统计学方法 细胞吸光度值（a）和bcl-2表达用均数±标准差（±s）表 达，多组间比较，采用方差分析。计数资料用χ2检验。所有数据均用sas软件包 进行统计。p＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果2.1 大蒜素、顺铂和大蒜素+顺铂对ishikawa细胞增殖的影响 本实验结果 显示，当顺铂浓度为1.0 mg/l时，对ishikawa细胞生长有轻度抑制作用，但与对照 组比较，差异无统计学意义（p＞0.05）。即顺铂在该浓度时对细胞生长无影响， 见表1。
而大蒜素和大蒜素+顺铂组均对细胞有明显的抑制作用（p＜0.01）,且在两 组内随着时间和浓度的增加，增殖抑制率升高，增殖抑制率与时间和浓度之间具 有显著正相关性（p＜0.01）。各浓度的大蒜素单独作用后的细胞抑制率低于与 之相对应的大蒜素和顺铂联合作用下的增殖抑制率，两者相比，差异有统计学意 义（p＜0.01），见表2。
2.2 大蒜素和大蒜素+顺铂对ishikawa细胞的生长周期和凋亡率的影响 经 fcm检测发现，ishikawa细胞周期分布和凋亡率发生改变。大蒜素组（12.5～50 mg/l）g2/m期细胞含量分别为（9±1.1）%、（28±0.6）%、（40±2.6）%，凋亡 率为分别为（5.41±1.39）%、（7.38±2.08）%、（18.46±1.47）%；
大蒜素（12.5 ～50 mg/l）+顺铂（1 mg/l）组g2/m期细胞含量分别为（18±1.6）%、（39±2.2）%、 （56±4.6）%，凋亡率为分别为（15.17±2.63）%、（28.67±2.19）%、（43.07±1.12）%。
与对照组相比，两组g2/m期细胞含量比例上升，凋亡率亦上升。大蒜素联合顺铂 组较单独使用大蒜素组，其g2/m期细胞含量和凋亡率明显升高（p＜0.01），且 各组内差异亦有显著统计学意义（p＜0.01），并在g1峰前出现细胞凋亡峰。
2.3 ishikawa细胞端粒酶活性的表达 经不同浓度的大蒜素处理24、48、72 h 后，细胞中端粒酶的活性呈现出随时间和浓度增加而降低的趋势，而大蒜素联合 顺铂组细胞中端粒酶活性的降低较单纯使用大蒜素更明显，且与对照组比较，其 差异有显著统计学意义（p＜0.01），见表3。
2.4 ishikawa细胞bcl-2的表达 ishikawa细胞核出现棕黄色颗粒为阳性染色， 经不同浓度的大蒜素处理24、48、72 h后，细胞中bcl-2的含量呈现出随时间和浓 度增加而降低的趋势，而大蒜素联合顺铂组细胞中bcl-2的含量降低较单纯使用大 蒜素更明显，两者相比差异有显著性意义（p＜0.01），且各组内差异亦有显著 性意义（p＜0.01），见表4。表1 作用48 h对照组与顺铂组的细胞吸光度值表2 不 同时间大蒜素组和大蒜素+顺铂组的细胞相对抑制率表3 不同时间大蒜素和大蒜 素+顺铂组对细胞端粒酶活性的影响 表4 不同时间大蒜素及联合组对细胞bcl-2 含量的影响 注：各浓度组比较p0.01；
各时间组比较，p＜0.013 讨论 大蒜是百合科葱属植物的鳞茎，主要的生物活性物质是其特有的含硫化合 物，其具有降低肿瘤的危险性和抗肿瘤的生物学作用，而无明显的不良反应；
而 顺铂是目前应用最广泛的抗肿瘤药物，但其水溶性差、口服活性低、缓解期短、 毒副作用较强，大剂量或连续用药可致严重而持久的肾毒性、听觉衰退等现象。
故大蒜和顺铂联用能否既减少化疗药物的应用，减轻不良反应，又能够达到同样 甚至更强的治疗效果，是本研究的主要目的。
3.1 大蒜素单独和联合顺铂应用对子宫内膜癌ishikawa细胞增殖的影响 本实验中，单纯应用大蒜素于人子宫内膜癌ishikawa细胞，所用剂量分别为12.5、 25、50 mg/l。药物作用24、48、72 h后，经mtt检测所得抑制率与对照组比较， 随着药物浓度和作用时间的增加，抑制率明显增高。表现为时间和剂量依赖关系。
而顺铂作为治疗肿瘤的首选药物，其疗效是肯定的。本实验采用较低剂量的顺铂 作用于人子宫内膜癌ishikawa细胞，浓度分别为1、2.5、5.0 mg/l，作用72 h后抑 制率分别为（1.96±0.127）%、（19.02±0.189）%、（37.86±0.162）%。而当顺 铂浓度为1 mg/l时，其抑制率与对照组无统计学意义。表明顺铂为该浓度时对细 胞无影响。本实验研究发现，若将1 mg/l的顺铂分别与不同浓度的大蒜素联合应 用，药物作用24、48、72 h后，所得抑制率较对应的大蒜素组明显提高，表现为 时间和剂量依赖关系。因而可大胆设想，在化疗药物无治疗作用的浓度时，加用 大蒜素，对化疗药物有增敏作用，较单独应用大蒜素对肿瘤细胞的抑制更明显。
3.2 大蒜素单独和联合顺铂应用对子宫内膜癌ishikawa细胞凋亡和细胞周 期的影响 目前，有学者认为肿瘤是一类细胞周期疾病。他们认为许多癌基因、 抑癌基因直接参与了细胞周期的调控，或者本身就是细胞周期调控的主要成分， 他们突变的结果，导致细胞周期的失控，包括细胞周期启动、运行和终止的异常， 使细胞获得以增殖过多、凋亡过少为主要形式的失控性生长特征。细胞周期存在 着g1/s转换和g2/m转换两个重要的控制位点。而细胞凋亡（apoptosis）是一种由 基因控制的细胞自主死亡方式。它是由遗传控制，受既定程序（或基因）调控的， 是程序性的细胞死亡。miron等［1］研究发现，大蒜素能抑制hl60和u937细胞的 生长并诱导其凋亡。seki等［2］报道，大蒜素诱导人类结肠癌细胞（hct-15和dld-1） 的凋亡，并将细胞周期阻滞于g2/m期，且呈时间和剂量依赖关系。本研究采用fcm 及细胞形态学检测手段观察了大蒜素单独和联合顺铂对子宫内膜癌ishikawa细胞 凋亡和细胞周期的影响。透射电镜下可见到凋亡小体。fcm分析发现，大蒜素作 用24、48、72 h后，细胞凋亡率和g2/m期细胞比例上升，其差异有显著统计学意义（p＜0.01）；
而大蒜素联合顺铂组其细胞凋亡率和g2/m期细胞比例较单纯大 蒜素组上升更明显，且出现亚二倍体峰即细胞凋亡峰，呈时间和剂量依赖关系。
在透射电镜下可见到凋亡小体。由此推断大蒜素单独和联合顺铂将ishikawa细胞 阻滞于g2/m期，诱导细胞凋亡，从而控制了肿瘤细胞的增生。
3.3 大蒜素单独和联合顺铂应用对子宫内膜癌ishikawa细胞端粒酶活性和 bcl-2表达的影响 端粒酶由rna和蛋白质组成的一种核糖核蛋白复合物（rnp）,含 有端粒重复序列的模板，即以自身rna组分为模版，复制合成端粒序列。正常细 胞周期中，细胞每分裂一次，端粒子链即缩短一次，经过若干分裂周期后，端粒 缩短到临界长度时，细胞进入凋亡，端粒酶检测为阴性。因此端粒的缩短限制了 细胞增殖能力。而癌细胞则是在某些机制作用下，启动端粒酶表达而使染色体端 粒稳定的维持在一定长度，从而使癌细胞得以持续增殖，并获得永生化［3］， 此时端粒酶检测阳性。有研究表明，人类肿瘤中85%左右的肿瘤细胞存在端粒酶 活性的表达［4］。
端粒酶rna（htr）是端粒酶的重要组分之一。mese等［5］的研究表明端粒 是顺铂发挥作用的靶点。顺铂作为dna损伤剂，其同dna的连接方式主要为g-p1-g 和a-p1-g的形式，而端粒酶和端粒酶htr的碱基顺序正是富含这种结构。因而顺铂 抑制了htr的表达，从而对端粒酶活性进行了调节。
本实验结果显示，大蒜素能够诱导细胞凋亡（阻滞于g2/m期），其原因可 能和端粒酶活性下降有关。端粒酶活性下降后，端粒缩短，细胞有丝分裂受阻， 导致细胞凋亡。sharma等［6］研究发现凋亡抑制基因bcl-2能够调节端粒酶活性， 当bcl-2过量表达时，端粒酶活性增强；
当bcl-2表达量下降后，端粒酶活性也下降。
filomeni等［7］研究发现，大蒜素能够下调bcl-2的表达。xiao等［8］研究发现,dats 能诱导人类前列腺癌细胞pc-3和du145的凋亡，其机制是通过c-jun氨基末端激酶 （c-jun n-terminal kinase，jnk）和erk（extracellular signal-regulated kinase）信 号通路介导的bcl-2磷酸化，bcl-2磷酸化后使得它抑制凋亡的功能丧失，受损的靶 细胞发生凋亡。
本研究结果显示大蒜素及联合组在诱导ishikawa细胞凋亡的同时，端粒酶 活性受抑制，bcl-2的表达下降，而且呈时间依赖性和剂量依赖性。联合组较与之 相对应的各浓度大蒜素组抑制更明显。提示大蒜素在体外诱导凋亡的同时伴随 bcl-2表达水平的下调及端粒酶活性的下降，表明大蒜素诱导ishikawa细胞凋亡的 调控与细胞端粒酶表达之间存在密切联系，bcl-2可能是联系细胞凋亡和端粒酶调 节之间的重要纽带。本实验显示大蒜素联合顺铂与单独应用大蒜素相比，大蒜素可增强顺铂对端粒酶活性的抑制作用，促进细胞的凋亡率。从而为临床上联合应 用大蒜素，减少化疗药物的使用及其不良反应，而达到同样甚至更好的治疗效果 提供理论依据。