人参皂苷提取物对酒精性肝损伤的保护性探究
人参皂苷提取物对酒精性肝损伤的保护性探究 人参是多年生草本植物，生长于北纬33度—48度之间的海拔，数百米 的以红松为主的针阔混交林或落叶阔叶林下，产于中国东北、朝鲜、韩国、日本、 俄罗斯东部。人参的别称是黄参、地精、神草、百草之王，是闻名遐迩的“东北 三宝”之一，与琼珍灵芝，东阿阿胶被称为中药国宝。人参为五加科植物人参PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根，红参是人参 经过高温炮制后得到的加工品。人参具有抗氧化、抗衰老、提高机体免疫力及护 心保肝等药理作用。乙醇在体内主要经肝脏代谢，其代谢物乙醛及代谢过程中产 生的活性氧会对肝脏造成损害，长期饮酒和过量饮酒，会造成乙醇在体内堆积， 对肝脏造成不同程度的损伤，损伤程度从轻到重表现为脂肪肝、肝纤维、肝硬化 [1],引起机体内天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、三酰甘 油(TG)、丙二醛(MDA)等生化指标水平增高。人参皂苷是红参的主要活性成分， 《中国药典》和国家标准均以人参皂苷为红参的考核指标。近年来，有研究发现 红参具有保肝功能[2-3],本文旨在研究人参皂苷提取物对小鼠酒精性肝损伤的防 治作用，揭示作用机制，为红参的临床应用提供依据。
1材料与与仪器 1.1仪器 InfiniteM200pro酶标仪(瑞士帝肯);Lecia-DM2500微生物显微镜，德国 Lecia公司。
1.2药物与试剂 鲜人参，为5年生，产自吉林省抚松县，由长春中医药大学王淑敏教 授鉴定为五加科人参属人参PanaxginsengC.A.Meyer干燥根;联苯双酯滴丸(浙江 万邦药业有限公司，批号A02130407);56°北京红星二锅头酒(北京红星二锅头酒厂， 批号20140224);ALT试剂盒、AST试剂盒、MDA试剂盒、GSH试剂盒(南京建成生 物工程研究所，批号20150112);TG试剂盒(浙江东瓯生物工程有限公司，批号 2015040104)。
1.3实验动物 清洁级ICR雄性小鼠，体质量20~22g,由吉林大学基础医学院动物实验中心提供，动物合格证号：SCXK-(吉)2014-005. 2实验方法 2.1红参炮制 称取鲜人参约300g,用纱布包好，放入蒸参箱，在60min升温到100℃ 后蒸制6h,蒸制完毕后置于50℃烘干箱内烘干。将烘干后的红参研碎成粉，过80 目筛。
2.2人参皂苷提取物(Ginsengsaponinextracts,GE)制备 称取红参粉末，加入8倍量80%乙醇，超声提取(500W,100Hz)30min, 抽滤，滤渣加入6倍量乙醇超声30min,滤过，合并滤液，40℃水浴蒸干，加入适 量水溶解，即得人参皂苷提取物(人参总皂苷含量为3.84%)，4℃下保存待用。
2.3动物分组 取清洁级ICR雄性小鼠72只，正常喂养5d后，将其按体重平均分为6 组，分别为对照组、阳性组(联苯双酯)、模型组及GE高、中、低剂量组，每组12 只。
2.4动物造模及给药 给药剂量按照成人日均用药量与小鼠给药量进行剂量换算，除对照组 每天ig等体积的蒸馏水外，其余各组ig给予56°白酒，给药剂量为0.2mL/20g,1次/d, 造模5d.给药组给予GE,低、中、高剂量组每日分别给予0.38、0.75、1.13g/kg生药 材浓度的GE,阳性对照组给予联苯双酯0.90mg/kg,给药后1h给予56°白酒，1次/d, 连续30d.小鼠给药期间每周进行称质量并记录，并观察小鼠的毛色、饮食、行为 及死亡情况。
2.5样本采集 处理前禁食12h,给药及白酒1h后，小鼠摘眼球取血，常温静置后待其 凝固，3000r/min离心15min,取血清，80℃保存待测。采血后，迅速剖取肝脏，用 冷生理盐水洗净，滤纸吸湿后，称取肝脏湿重，计算肝脏系数(肝脏系数=肝质量 /体质量)。取肝右叶做HE染色，肝左叶制备10%肝匀浆，匀浆制备方法：用冷生 理盐水冲洗肝脏至无血色，称质量，加入9倍量冷生理盐水机械匀浆，将匀浆液2500r/min离心20min,4℃，取上清。
2.6生化指标检测 每组取同等样本量的小鼠血清及肝匀浆，严格按照试剂盒操作方法进 行小鼠血清ALT、AST、TG、肝匀浆MDA、GSH含量测定。
2.7肝组织病理学检查 取小鼠肝脏右叶置于10%中性福尔马林中进行固定，经一定梯度浓度 的乙醇脱水、石蜡包埋、切片进行HE染色，用显微镜观察肝组织病理变化。
2.8数据处理 应用SPSS19.0统计软件进行统计分析，采用单因素方差分析，组间比 较采用最小显着差数法(LSD)，数据均以x±s表示。
3结果 3.1小鼠状况观察 试验期间，GE中剂量组及阳性组死亡小鼠4只，其余各组死亡小鼠2 只。对照组小鼠精神状态正常，毛色正常，模型组小鼠毛色较差，造模期间，ig 给予白酒后20min左右，出现醉酒状态，不自主行为增多，爬行不稳，有些小鼠 呈现昏睡状态，给药组小鼠给予白酒20min后，醉酒状态较模型组稍好。
3.2体质量及肝脏系数变化 各组小鼠体质量无统计学差异，与对照组相比，模型组小鼠肝质量增 大(P0.05)，表明长期饮酒和乙醇的堆积造成小鼠肝脏受损肿大，质量增加可能与 肝脏内脂肪堆积或其他物质生成有关。给药组小鼠肝脏系数相较模型组有明显降 低(P0.05)，GE高、中、低剂量组均有降低，但组间变化趋势不明显，GE对酒精 引起的小鼠肝脏受损肿大有一定的缓解作用。见表1. 3.3对小鼠血清ALT、AST、TG的影响 与对照组相比，模型组小鼠血清ALT(P0.05)、AST(P0.05)、TG(P0.01) 含量明显升高;与模型组相比，GE高、中剂量组ALT含量降低(P0.01)，GE各剂量组均能降低AST和TG水平(P0.01)，联苯双酯组可明显降低ALT、AST水平。但 GE高、中、低剂量组组间呈现的量效关系不明显。长期白酒灌胃会造成小鼠血 清ALT、AST、TG含量增高，GE可明显降低血清TG的含量，对ALT、AST含量 降低有一定作用，说明GE对小鼠酒精性肝损伤有一定保护作用。见表2. 3.4对小鼠肝脏MDA、GSH的影响 小鼠肝匀浆MDA含量结果显示，模型组小鼠MDA含量高于对照组 (P0.01)，GE各剂量组MDA含量低于模型组(P0.01)。模型组GSH含量低于对照组 (P0.01)，GE各剂量组GSH含量高于模型组(P0.01)，GE可降低MDA含量，增加 GSH含量，说明其可在一定程度上抵御肝脏内的氧化作用，从而保护肝脏进一步 损伤。见表3. 3.5病理观察结果 正常组肝细胞结构正常，肝细胞条索排列整齐;模型组肝细胞变性坏 死，有炎性细胞浸润，脂泡小而密集;联苯双酯组炎性细胞浸润和坏死程度减轻。
4讨论 本研究采用长期、固定剂量的酒精灌胃造模方法[4-5]来模拟长期饮酒 的状态，形成慢性酒精性肝损伤模型。通过实验观察，长期灌胃白酒的小鼠，不 自主行为增多，会出现嗜睡、四肢无力、食欲减退、呼吸衰竭等状态，模型组小 鼠的生化指标也表明长期白酒灌胃引起的肝功能的损伤，长期、固定剂量的酒精 灌胃引起小鼠慢性酒精性肝损伤是可行的。
ALT、AST是检验肝脏损伤的一个重要指标，正常血清里ALT、AST 含量极少，只有在肝细胞死亡破裂后肝细胞内的ALT、AST才会释放入血，血清 中ALT、AST含量增加说明肝脏出现炎症。乙醇经肝脏代谢过程中产生的活性氧 会直接对肝细胞造成氧化损伤[6],形成过脂质氧化产物--MDA,其含量是细胞氧 化损伤的一个重要检测指标。模型组小鼠肝组织MDA含量高于正常组，GSH含 量低于正常组，肝脏长期的酒精代谢会造成肝脏内氧化物质的增多，还原物质减 少，造成肝细胞氧化损伤。
同时肝脏脂质过氧化会产生脂肪酸的氧化，影响肝脏微管功能，致使 肝脏内TG代谢障碍，长期的乙醇摄入，不仅增大了小鼠的肝质量、肝脏系数， 也致使模型组小鼠较正常组小鼠TG的量明显增多。红参醇提液中的成分主要是人参皂苷，红参中含有20多种人参皂苷， 如人参皂苷Re、Rb1、Rh1、Rh2、Rd等，其人参皂苷Rg3、Rg2、Rh1的含量高 于白参[7].研究发现人参皂苷20(S)-人参皂苷Rg3可明显抑制肝损伤小鼠ALT、 AST的酶活性[8],人参皂苷Rb1可明显降低大鼠肝微粒体细胞色素P450酶与 NADPH-P450的活性[9],人参皂苷Rh2可抑制肝纤维DNA的合成[10]等。通过本研 究发现，GE可明显降低长期白酒灌胃小鼠血清中TG的含量，对降低其ALT、AST 作用不明显，对抑制肝脏内MDA的含量，增加GSH含量有一定作用，对长期饮酒 所造成的肝损伤有一定的预防和保护作用，从而阻止肝脏向纤维化进一步恶化。
GE中、高剂量组与模型组的病理观察比较，GE可在一定程度上抑制肝细胞炎症 发生，但抑制效果不明显，但可以显着减少小而密集的脂肪泡数量，GE中、高剂 量组可明显抑制肝脏内的泡样损伤。GE可能主要通过抑制体内活性氧对肝脏脂质 过氧化、减少肝脏脂肪堆积这一途径来避免肝脏受损。
综合以上结果，人参皂苷提取物对小鼠酒精性肝损伤有一定的保护作 用，以中、高剂量效果最好，但红参保肝机制尚不明确，此研究为红参的保健开 发和治疗酒精性肝损伤提供了一定的参考。