RP-HPLC 法检查丁酸氯维地平原料药中的有关物质
RP-HPLC 法检查丁酸氯维地平原料药中的有关物质 丁酸氯维地平(Clevidipine butyrate)系第3代新型短效二氢吡啶类注射用钙 通道拮抗剂，治疗不宜口服或口服无效的高血压患者，尤其是对手术期间血压急 性升高的降压效果明显。地平类降压药是降压药中市场占有量最大、应用最广泛 的药物，由于丁酸氯维地平受到专利限制(商品名 Clev-iprex，注射乳剂，上市时 间为 2008 年 8 月，临床用于降血压，尤其适用心脏手术期间的血压急性升高)， 国内外相关文献资料极少，国内外药典也均未收载丁酸氯维地平原料药有关物质 分析方法。随着其专利期临近，国内外会有更多关于丁酸氯维地平的研究陆续开 展。为规范丁酸氯维地平原料药的合成与使用，提高其相关制剂的安全性和有效 性，笔者采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法检查丁酸氯维地平原料药中的有关 物质，对丁酸氯维地平工艺中可能产生的工艺杂质和降解杂质等进行研究，并计 算已知杂质相对于主成分的校正因子，最后以不加校正因子的主成分自身对照法 来计算单个杂质和总杂质的量，从而为丁酸氯维地平原料药的质量控制提供依据。1 材料 1.1 仪器 1200型HPLC仪，包括G1314可变波长检测器(VWD)、Chemstation 色谱工 作站等(美国 Agilent 公司);BP-211D 电子天平(德国赛多利斯公司)。
1.2 药品与试剂 丁酸氯维地平对照品[简称对照品 A，4-(2，3-二氯苯基)-1-4-二氢-2-6-二 甲基-3，5-吡啶二甲酸甲基(1-丁酰氧基)甲酯，批号：120929，纯度：99.6%]、样 品丁酸氯维地平原料药(批号：20130801、20130802、20130803，纯度：99.90%、 99.85%、99.90%)、杂质B对照品[4(-2，3-二氯苯基)- 2-6-二甲基-1-4-二氢吡啶-3， 5-二羧酸单甲酯，批号：130311，纯度：98.7%]、杂质C 对照品[4-(2，3-二氯苯 基)-2，6-二甲基-烟酸甲酯，批号：130112，纯度：99.1%]、杂质D 对照品[4-(2， 3-二氯苯基)-2，6-二甲基-1，4-二氢吡啶-3，5-二羧酸二甲酯，批号：130429， 纯度：98.4%]、杂质E对照品[4(-2，3-二氯苯基)-2，6-二甲基吡啶-3，5-二羧酸-3- 丁酰氧甲基酯-5-甲酯，批号：130506，纯度：98.6%]、杂质F对照品[4-(2，3-二 氯苯基)-2，6-二甲基-1，4-二氢吡啶-3-羧酸甲酯，批号：130303，纯度：99.0%]、 杂质G对照品[4-(2，3-二氯苯基)-2，6-二甲基-1，4-二氢吡啶-3，5-二羧酸-3-丁酰 氧甲基酯-5-乙酯，批号：130321，纯度：99.2%]、杂质H 对照品[4(-2，3-二氯苯基)-2，6-二甲基-1，4-二氢吡啶-3，5-二羧酸二丁酰氧甲基酯，批号：130402， 纯度：99.3%]，均来源于上海信谊药厂有限公司;甲醇、乙腈均为色谱纯，磷酸 为分析纯，水为去离子水。
2 方法与结果 2.1 溶液制备 2.1.1 系统适用性溶液。精密称取对照品A 20 mg，置于10ml 量瓶中，定 量加入杂质 B～H 的对照品溶液(2.1.4项下溶液)1 ml，用乙腈溶解并稀释制成含 丁酸氯维地平质量浓度约为2.0 mg/ml、各杂质质量浓度约为2 g/ml的溶液，即得。
2.1.2 供试品溶液。精密称取样品丁酸氯维地平原料药约20mg，置于 10 ml 量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度，即得(2.0mg/ml)。
2.1.3 对照溶液。精密量取2.1.2项下供试品溶液1.0 ml，置于100 ml量瓶中， 加乙腈稀释至刻度，摇匀，即得1%对照溶液。
2.1.4 杂质对照品溶液。分别取杂质B～H对照品约10 mg，置于50 ml量瓶 中，用乙腈溶解并定容至刻度;精密量取该溶液1.0 ml，置于10 ml量瓶中，用乙 腈稀释至刻度，制成各杂质质量浓度为20.0 g/ml的溶液。
2.2 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Waters Symmetry ShieldTM(250 mm4.6 mm，5检测器为可变波长 检测器(VWD);流动相：A 相为 20mmol/L 磷酸二氢钠水溶液(加 10 ml 四丁基 氢氧化铵，制成1 000 ml，并用磷酸调pH=5.0)，B相为乙腈，梯度洗脱，流速：
1.2 ml/min;检测波长：220 nm;进样量：20 柱温：35 ℃。
2.3 检查方法 取对照溶液20 l注入色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为 满量程的20%～25%。再精密量取对照溶液和供试品溶液各20 l，分别注入色谱 仪中，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。扣除溶剂峰，与系统适用性色谱 图中保留时间相对应，B～H杂质峰面积均不得大于对照溶液主峰面积的 1/10(0.1%);其他单一杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的1/10(0.1%);各杂质 峰面积总和不得大于对照溶液主峰面积的1.5倍(1.5%)。2.4 专属性试验 取对照品A 20 mg，置于10 ml量瓶中，共6份，1份为未破坏，另5份分别 按下列条件进行破坏。(1)高温破坏：在温度120 ℃ 烘箱中放置约 8 h。(2)光破 坏(紫外灯)：在紫外灯(4 500 lx)中放置约15 d。(3)酸破坏：加1 mol/L盐酸1 ml， 放置约8 h;用1 mol/L氢氧化钠1 ml中和酸。(4)碱破坏：加0.1mol/L 氢氧化钠 1 ml， 放置约 8 h;用 0.1 mol/L 盐酸 1 ml 中和碱。(5)氧化破坏：加30% H2O2溶液1 ml 后，在室温下放置约8 h。
取各破坏后样品溶液进样分析，结果未破坏及各破坏 后样品的主峰含量分别为 100%、88.57%、93.76%、92.22%、91.53%、89.81%， 主峰纯度分别为999.934、999.949、999.951、999.745、999.946、999.962。
3 讨论 3.1 建立丁酸氯维地平原料药中有关物质检查方法的意义 随着科技水平的提高，人们对药品质量、安全性的重要性有了更加充分的 认识。而药物中的杂质与药品质量、安全性密切相关。目前国内对丁酸氯维地平 研究重在合成工艺上，其有关物质的研究未见报道。笔者希望通过对有关物质的 研究和质量控制，实现对丁酸氯维地平原料药的质量监控。
3.2 检测波长的选择 取丁酸氯维地平原料药、对照品及各杂质对照品各适量制备成对应溶液， 分别在190～400 nm波长范围内进行紫外扫描。结果显示，各对照品均在220 nm 波长具有大吸收，且丁酸氯维地平样品溶液在220 nm以外波长处并无更多杂质峰 出现，故选择220 nm为检测波长。另外，用二极管阵列检测器检测各溶液，得到 的吸收光谱也证实了样品和其各杂质在220nm 波长处均有最大吸收或较强吸收。
3.3 流动相的选择 试验中曾配制流动相使其pH接近2、磷酸二氢钠缓冲盐溶液溶度为60 mmol/L，虽然主峰与相邻杂质及杂质间分离度达到要求，但其对色谱柱损伤较 大。后采用甲醇-乙腈(3∶2，pH=4)，但主峰与相邻杂质峰的分离度不佳。因此 尝试降低其中甲醇比例。当缓冲液与甲醇比例达1∶1时，丁酸氯维地平与相邻杂 质的分离度符合要求，但杂质E峰对称性较差，且杂质G保留时间太长(约60 min)。
为使主峰和杂质B～H的峰均达到理想的分离度和良好峰形，且溶剂峰在220 nm 波长末端吸收良好，经一系列的摸索，最终采用水相为20 mmol/L磷酸二氢钠、有机相为乙腈的流动相系统，梯度洗脱，结果满意。
综上，本方法简便、可靠、灵敏，不但可用于检查丁酸氯维地平原料药中 有关物质的量，同时还可将各有关物质与主成分有效分离，故本法可以作为丁酸 氯维地平原料药中有关物质的质量控制方法。