ODC和AdoMetDC双反义腺病毒载体对食管癌细胞凋亡
ODC和AdoMetDC双反义腺病毒载体对食管癌细胞凋亡 【摘要】 目的 探讨odc和adometdc双反义腺病毒载体 (ad odc adometdcas)对食管癌eca109细胞凋亡作用的影响。方法 应用mtt法实 验观察ad odc adometdcas对食管癌eca109细胞生长增殖的影响；采用western 印迹和hplc分别检测腺病毒载体对食管癌eca109细胞中odc和adometdc蛋白表达 以及胞内多胺含量的抑制作用,同时应用原位末端标记（tunel）法观察 ad odc adometdcas对食管癌eca109细胞凋亡作用的影响,应用透射电镜进一步 观察细胞超微结构的改变。结果 应用mtt法实验表明，ad odc adometdcas对食 管癌eca109细胞生长增殖有显著抑制作用（p0.05）。以ad odc adometdcas感 染食管癌eca109细胞，可明显抑制食管癌eca109细胞中odc和adometdc基因表达 （p0.05）。hplc结果显示，食管癌eca109细胞感染ad odc adometdcas后,细胞 内三种多胺含量均明显降低（p0.05）。tunel标记检测结果显示， ad odc adometdcas可明显引起食管癌eca109细胞凋亡（p0.05）,透射电镜下可 见典型的细胞凋亡特征,表现为细胞体积缩小，核皱缩、碎裂,染色质呈块状边集 等。结论 odc和adometdc双反义腺病毒载体能显著抑制食管癌细胞生长增殖,降低 细胞多胺合成,促进细胞凋亡，为探讨食管癌基因治疗的可行性提供了实验依据。
WWw.133229.Com 【关键词】 鸟氨酸脱羧酶 s 甲硫氨酸脱羧酶 多胺 食管肿瘤 基因治疗 virus on esophageal cancer cell eca109 xu jie1, tian hui1, liu xian xi2, zhang bing2, li wen jun1, song xu1 (1. department of thoracic surgery, qilu hospital of shandong university;
2. experimental center of medical molecular biology, school of medicine, shandong university， jinan 250012, china) to explore the inhibitory effects of ad odc adometdcas on polyamine biosynthesis and esophageal cancer cell apoptosis. methods adenovirus mediated gene transduction efficiency was assessed by counting the gfp positive cells by using mtt. the malignant phenotype of the eca109 cells was assessed by a growth curve. western blot and hplc were used to determine the odc and adometdc expressions and polyamine content in eca109 cells. tunel was used to analyze cell apoptosis. morphology of the apoptotic cells was observed by an electron microscope. result approximately 70% of the eca109 cells were infected with ad odc adometdcas when moi reached 50. the expression of odc was inhibited in the infected tumor cells. ad odc adometdcas could inhibit the eca109 cell growth and invasive ability. tunel proved that ad odc adometdcas could lead to cellapoptosis. under an electron microscope, chromatin condensation, nuclear disintegration and formation of apoptotic bodies were found. conclusion ad odc adometdcas has significant inhibitory effects on esophageal cancer cell proliferation, leads to cell apoptosis and has therapeutic potential for the treatment of esophageal cancer. key words：
ornithine decarboxylase；
s adenosylmethionine decarboxylase；
polyamine；
esop neoplasms；
gene therapy 多胺是存在于所有生物中脂肪族多聚离子,主要包括腐胺（put），精 脒（spd）和精胺（spm）。多胺通过改变dna结构和调节信号传导途径等方式调 节基因的表达，从而在细胞生长和分化过程中发挥重要作用。有研究发现［1］ 410，在肿瘤细胞和组织中多胺的含量和生物合成明显增高。鸟氨酸脱羧酶 (ornithine decarboxylase，odc)是多胺生物合成途径中第一个限速酶，可催化l 鸟 氨酸脱羧生成腐胺。s 腺苷甲硫氨酸脱羧酶（s adenosylmethionine decarboxylase, adometdc）是多胺合成的第二个限速酶。主要是催化s 腺苷甲硫 氨酸(s adenosylmethionine, sam)脱羧基, 形成脱羧的sam(dcsam)，为spd和spm的 合成提供丙氨基。虽然odc一直是研究的焦点，但adometdc活性在许多人类肿瘤 中也明显升高。过表达adometdc可以促使nih3t3细胞的恶性转化，较odc可能是更 有力的转化诱导剂。抑制odc和adometdc的活性可以防治肿瘤的形成和转移［2］ 980。因此odc和adometdc是肿瘤治疗的重要靶标。
为了探讨同时抑制odc和adometdc表达，降低细胞内多胺的含量对食 管癌的治疗作用，本研究在构建的odc单反义腺病毒的基础上［1］411；
［3］641, 又构建了可以同时表达odc和adometdc反义rna双反义腺病毒载体 (ad odc adometdcas),研究对食管癌eca109细胞凋亡作用的影响，以探讨其作为 食管癌基因治疗方法的可能性。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株 eca109细胞购自中科院上海细胞所,携带绿色荧光蛋白 （green fluorescence protein，gfp）基因的重组腺病毒ad gfp, ad odcas和 ad odc adometdcas由山东大学医学院分子生物学实验中心包装完成［2］982。
1.1.2 主要试剂 dmem、rpmi 1640培养基购自gibco公司，胎牛血清购 自杭州四季青生物工程材料有限公司；
mtt、odc抗体购自sigma公司。tunel试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2 方法 1.2.1 重组腺病毒ad odc adometdcas感染效率的测定 将生长良好 的eca109细胞经适当培养后，调至浓度为5×104／ml，按每孔100μl接种于96孔培 养板中。培养24h后，分别被ad odc adometdcas和ad gfp以100、50、25、10、 1的感染复数(mutiple of infection, moi)感染，每组6个复孔。作用后48h，加入 5mg/ml的mtt溶液20μl／孔，37℃作用4h后弃培养液，每孔加入dmso150μl，振荡 10min，酶标仪（bio rad model 680）测定570nm处的吸光值。
1.2.2 mtt实验和细胞生长曲线 将对数生长期的eca109细胞按5×103/ 孔接种于96孔培养板，于37℃、5%co2培养箱中培养。24h重组腺病毒 ad odc adometdcas与空病毒ad gfp分别以50、25 moi感染eca109细胞，对照组 为不含病毒的培养液，每个组设6个复孔。于处理后24、48、72和96h加入0.5％ 的mtt（5mg/ml），每孔20μl，孵育4h，再加入二甲基亚砜150μl溶解紫蓝色沉淀。
酶标仪测定570nm波长吸光值，绘制生长曲线。
1.2.3 western blot检测odc,adometdc蛋白的表达 1×106 eca109细胞分 别感染50moi的ad gfp,ad odcas和ad odc adometdcas 72h后收集细胞。用裂 解液抽提细胞总蛋白,裂解液组分：50mmoj/ltris(ph 8.0), np 40(1%), aprotinin(1μg/ml),十二烷基磺酸钠(0.1%), 叠氮钠(0.02%),氯化钠(150mmol/l), pmsf(100μg/ml)。蛋白样品浓度采用bca法测定,经sds page（12％分离胶）电泳, 电转移到硝酸纤维素膜上。5%脱脂奶粉封闭2h,一抗4℃孵育过夜,加入hrp标记的 二抗室温孵育2h后,采用supersignal west pico化学发光底物曝光显影。β肌动蛋白 表达作为内参照。
1.2.4 细胞内多胺含量的测定 收集107个细胞，用冰冷的pbs冲洗2 遍；
1000r/min离心5min收集细胞沉淀，过多的pbs用棉棒轻轻沾去；
加入0.5ml 10％高氯酸到细胞沉淀中，4℃孵育30min；
12000×g离心3min，上清液可贮存于 -20℃。取丙酮溶解的丹酰氯200μl、细胞上清液200μl、已二胺50μl和饱和na2co3 50μl混匀；
50℃水浴30min；
加样分析。流动相a为甲醇，b为重蒸水。开始时ab 两液以8∶2混合入柱，10min内a液上升至100％，b液降为0，维持15min，流速 1ml/min。荧光激发波长370nm，发射波长506nm。纸速3mm/min,柱温40℃。
1.2.5 tunel标记检测法 腺病毒ad odc adometdcas和ad gfp分别以50moi感染eca109细胞。将约5×107/ml的细胞于4%中性甲醛溶液温室中固定 10min,在载玻片上滴加100μl细胞悬液并使之干燥。pbs洗片，与0.3%h2o2甲醇溶 液室温孵育30min。pbs洗片，与通透液(0.1%tritonrx 100溶于0.1%枸橼酸钠溶 液中)在冰浴中孵育2min。pbs冲洗后擦干，滴加50μl tunel反应混合溶液，湿盒 中37℃孵育60min。加入50μl转化剂 pod，湿盒中37℃孵育30min。pbs冲洗，加 入100μl dab底物溶液，室温孵育10min。封片，在光镜下分析结果。
1.2.6 透射电镜下观察细胞超微结构的改变 收集上述各组细胞，4℃、 3％戊二醛液固定，1%锇酸固定，常规乙醇、丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，超 薄切片，铅铀双重染色，h 600a型透射电镜(日本日立公司)下观察并摄片。
1.3 统计学处理 数据以±s表示，采用spss version 12.0软件对数据进行 成组t检验。p0.05为差异有统计学意义。
2 结 果 2.1 重组腺病毒ad odc adometdcas对食管癌细胞生长的抑制作用 重组腺病毒ad odc adometdcas对食管癌细胞eca109有剂量依赖性的抑制作用 （p0.05），见图1。根据实验结果，挑选eca109细胞的感染滴度为50moi。正常 情况下，eca109细胞生长迅速，而感染ad odc adometdcas后细胞生长明显减慢， 细胞生长曲线更趋低平（图2），最大生长抑制率可达70%（p0.05），而无明显 细胞毒性。
eca109细胞感染不同滴度的ad odc adometdcas和ad gfp对细胞生 长的影响 fig.1 effect of different titer ad odc adometdcasand ad gfp on cell proliferation of the eca109 cellseffect of different viruses on proliferation of the eca109 cells2.2 腺病毒载体对odc和adometdc表达的影响 pbs,ad gfp,ad odcas 和ad odc adometdcas分别处理细胞72h后,western blot检测odc和adometdc表达。
结果显示，ad odcas处理组odc蛋白表达明显降低（p0.05）, adometdc没有明显 变化(p0.05)。而ad odc adometdcas处理组中odc和adometdc的表达在细胞中均 受到了明显抑制（p0.05），见图3。
2.3 腺病毒载体对细胞内多胺含量的影响 见表1。由表1可见， ad odcas和ad odc adometdcas在降低odc和adometdc表达的同时,也降低了体 内多胺的水平。单独孵育ad odcas 72h后, eca109细胞中put和spd含量明显降低(p0.05), spm下降不明显(p0.05)。在ad odc adometdcas处理的细胞中,三种多胺 的含量均有明显减少（p0.05）。表1 腺病毒对细胞内多胺含量的影响(pmol/mg 蛋白) 2.4 tunel标记检测结果 ad odc adometdcas作用后,eca109细胞出现 较明显的凋亡，而加入空病毒组和未加病毒组eca109细胞凋亡不明显(p0.05)，见 图4。
2.5 透射电镜观察细胞超微结构的改变 ad odc adometdcas作用 后,eca109细胞出现较明显的凋亡(p0.05)，还可见凋亡晚期的细胞，细胞核膜皱缩， 体积缩小，胞浆内空泡变性，形成新月体或聚集于核膜呈境界分明的块状边集现 象，见图5。
3 讨 论 基因治疗已是癌症治疗的研究热点，随着分子技术的不断提高，针对 特意靶分子的反义基因治疗在癌症治疗中显示了较好的前景。利用odc，adometdc 及多胺新陈代谢的调节为靶标进行肿瘤的治疗正成为近期的研究热点。多胺对原 癌基因表达有促进作用，可以独立地促进细胞转化，诱导细胞转化。胞内多胺浓 度增加是各种原癌基因引起的细胞转化的共同通路。多胺通过影响细胞增殖、分 化的信号转导通路，引起正常细胞的恶性转化；
通过促进核酸、蛋白质等生物大 分子的合成及肿瘤组织的血管生成，从而促进肿瘤增生。多胺的升高还与肿瘤的 侵袭密切相关。作为多胺合成的两个关键酶(odc和adometdc)，主要受到多胺浓度 的正负反馈调节。高浓度的多胺会抑制odc和adometdc的活性而低浓度的多胺则 会促进它们的活性。另外两者之间也存在着制约和互补的关系。单独抑制odc虽 然会导致put和spd的含量降低，但spm的含量却升高。其原因主要是抑制odc可导 致adometdc活性升高，从而使spm含量升高。同样，抑制adometdc易导致odc活性 和put含量升高。因此要使三种多胺含量都降低，就必须同时抑制odc和adometdc 活性。这也是本研究选择双反义腺病毒的原因之一。
本实验结果表明， ad odc adometdcas 可显著抑制eca109细胞的生 长增殖（p0.05），明显降低eca109细胞中odc和adometdc蛋白的表达量（p0.05）。
许多研究已证明［4 5］，抑制odc蛋白的活性和表达量，可减缓肿瘤细胞的生 长。最近对多胺类似物的研究表明［6］，多胺类似物取代多胺能达到抑制细胞 增殖的目的。choi等［7］研究发现，odc的主要调控者抗酶(az)的抑制剂(azi)在肺 癌a 549细胞中高表达，通过减少azi的表达，增加抗酶的活性，从而抑制odc, 减少多胺的生成。wallon等［8］的实验证明，细胞内多胺的水平调控着机体对致 癌物质的感应性。在许多肿瘤中抑制odc和adometdc可明显的抑制肿瘤生长，如 前列腺癌、乳腺癌、大肠癌和胰腺癌等［9 12］。结合本研究结果表明，抑制 odc和adometdc可取得明显的肿瘤抑制效用，odc和adometdc可作为有前景的肿瘤 反义基因治疗的靶基因。
尽管细胞内多胺含量是由合成、代谢、吸收和排出多个过程控制,但 癌细胞中多胺含量的增多主要与odc和adometdc的活性升高有关。有研究表明， 前列腺癌、乳腺癌和大肠癌中发现odc和adometdc活性升高［13］，并且与癌症 的复发关系密切［14］。最近研究发现［1］410；
［3］639，odc单反义腺病毒 可以抑制odc活性从而抑制肺癌的生长。但该病毒并没有抑制另一个多胺合成关 键酶adometdc的活性。该酶在肿瘤细胞中同样表达升高。因此推理，同时抑制odc 和adometdc可能对肿瘤治疗更为有效。本实验已证明在抑制odc基础上抑制 adometdc比单独抑制odc具有更好的抗食管癌效果。感染ad odc adometdcas的 eca109细胞中odc和adometdc表达量分别降低了50％和70％之多。三种多胺的含 量也都明显降低。相反ad odcas只抑制了put和spd的含量，而spm的含量与对照 细胞相比并未有实质性的改变。这可能与ad odcas只抑制odc而不抑制adometdc 表达有关。
为探讨odc和adometdc反义rna抑制肿瘤作用的机制，本实验采用tunel 标记检测法观察ad odc adometdcas对细胞凋亡的影响。与对照组细胞相比， ad odc adometdcas感染的细胞出现明显的凋亡（核膜皱缩，胞浆空泡变，胞核 破碎，染色质成块状聚集于胞膜处）。据报道［15］，在活性氧分子刺激后细胞 多胺水平的缓慢降低可导致其凋亡；
而odc过度表达则引起put的增多，也可诱发 凋亡。多胺的大量聚集或极度衰减可破坏细胞的许多功能，从而导致细胞凋亡。
因此，根据本研究结果推测，诱导细胞调亡是odc和adometdc反义rna抑制肿瘤生 长的机制之一。
总之，本研究结果表明，以odc和adometdc为靶标的反义腺病毒载体 可以降低食管癌细胞内多胺含量，能减少odc和adometdc基因的表达,抑制食管癌 细胞的体外生长和增殖, 并诱导细胞凋亡。因此采用基因治疗同时抑制odc和 adometdc可能成为一种新的食管癌治疗的方法，本实验结果为探讨食管癌基因治 疗的可行性提供实验依据。