PKCα反义核酸提高SMMC7721细胞对化疗药物的敏
PKC α反义核酸提高SMMC 7721细胞对化疗药物的敏 【摘要】 目的 探讨蛋白激酶c（protein kinase c）反义核酸（antisense oligonucleotides，asodn）联合5 fu、hcpt、as2o3三种化疗药物对肝癌smmc 7721 的体外高效抑制作用。方法 以聚乙烯亚胺（polyethyleneimine，pei）作载体转 染pkc α asodn，用wst 8法检测单纯使用5 fu、as2o3、hcpt三种化疗药物以及 其联合pei asodn对smmc 7721细胞的增殖抑制作用，并分别计算抑制率和ic50。结果 5 fu、as2o3、hcpt与pei asodn物联合使用后，其ic50分别降低到3.9μg/ml、 2.67μmol/l、1.46μg/ml,化疗药物的敏感性分别提高到单用化疗药物的2.86、1.84 和4.01倍。结论 pei介导的pkc α asodn与化疗药物5 fu、 as2o3、hcpt联合使用, 可提高肝癌细胞对化疗药物的敏感性,通过与化疗药物的相加或协同作用,减少化 疗药物的用量。
【关键词】 蛋白激酶c我反义核酸们肝肿瘤 化学治疗 聚乙烯亚胺 原发性肝癌是一种对化疗药物不敏感的恶性肿瘤[1] 。有报道在肝细胞癌 变过程中,细胞信号转导异常起到了关键的作用,其中pkc α表达异常与肝癌的发 生发展密切相关[2, 3]。反义寡脱氧核苷酸可以通过转录后抑制来抑制肝癌细胞 增殖、诱导凋亡，但是细胞摄取率低、易被核酸酶水解，且使用剂量过大，费用 昂贵。WWW.133229.COm阳离子聚合体pei作为asodn载体可以显著提高其转染效 率[4]。临床常规抗肿瘤药物虽然抗肿瘤效果肯定，但是其毒副作用大，易产生 耐药性，病人耐受差，同样难以起到令人满意的效果[５ ７]。因此，本实验研 究旨在探讨用聚乙烯亚胺作为载体，pkc α asodn联合5 fu、hcpt、as2o3等常规 抗肿瘤药物作用于肝癌细胞，增强常规化疗药物的抗肿瘤作用，降低用药剂量， 从而提高病人的生存时间和生活质量，减轻病人的经济负担。
１ 材料与方法 1.1 细胞培养 人肝癌smmc 7721细胞由中山大学生物化学教研室惠 赠；
用含10%新生牛血清，rpmi1640培养。
1.2 试剂 cck 8（cell count kit 8）试剂（日本同 仁化学研究所）；
新生牛血清（天津tbd 广州展晨）；
pkc α asodn（北京塞百盛基因技术有限公司）,全硫代修饰,page纯化, -20℃冻存,使用前用无酚红 rpmi 1640培养液溶解。pkc a antisense：5′ gttctcgctggtgagtttca 3′。
1.3 wst 8法检测细胞增殖抑制率 取对数生长期、苔盼兰拒染率 95%的 细胞, 调整浓度为5 ×104/ml, 每孔100μl, 接种于96孔板,设3 复孔, 培养4h, 待贴 壁达40%～50%后,加入药物。设空白对照组、单纯asodn组、单纯化疗药物组、 asodn 联合化疗药物组和pei asodn联合化疗药物组,各组pkc α asodn浓度均为 0.25μg/ml;
pei与pkc质量比为3∶4，见表1～3；
培养48h后, 每孔加入cck 8试剂 10μl, 继续培养1h, 多功能酶标仪(bio rad)测定吸光度a450nm (激发波长450nm, 参比波长655nm), 计算增殖抑制率及各组ic50；
增殖抑制率＝[a（对照组）－a（实 验组）]/a（对照组）×100%；
各化疗药增敏倍数＝单纯用药组的ic50/ 联合用药 组的ic50。
1.4 统计学方法 所有数据均用±s表示，使用统计软件spss 13.0。
1.5 金正均q值法[8]判断化疗药物与反义核酸联合使用的效果 q = ea + b/(ea + eb ea ×eb), ea和eb 分别为单用反义核酸和单用化疗药物的抑制率,ea + b为合并用药的抑制率。式中分子代表“实测合并效应”,分母是“期望合并效应”,q 值是两者之比,q 0.85为拮抗,0.85≤q 1.15为相加,q ≥1.15为协同。2 结果 2.1 5 fu与pei asodn联合使用效果 单用5 fu的ic50为15.64μg/ml;5 fu 与asodn联合使用,表现为拮抗作用(q0.85), ic50为26.74μg/ml;5 fu与pei asodn联 合使用,表现为协同作用(q≥1.15), ic50为3.9μg/ml, 增敏倍数为4.01,见表1、 4。
2.2 as2o3与pei asodn 联合使用效果 单用as2o3的ic50为4.93μmol/l;
as2o3与asodn 联合使用,表现为拮抗作用(q0.85), ic50为5.33μmol/l;
as2o3与 pei asodn联合使用,表现为相加作用(0.85≤q1.15), ic50为2.67μmol/l, 增敏倍数为 1.84，见表2、 4。
2.3 hcpt与pei asodn 联合使用效果 单用hcpt的ic50为4.18μg/ml;
hcpt与 asodn 联合使用,表现为相加作用(0.85≤q 1.15), ic50为3.1μg/ml，增敏倍数为1.34;
hcpt与pei asodn联合使用,表现为协同作用(q≥1.15), ic50为1.46μg/ml, 增敏倍数 为2.86,见表3、 4。
3 讨论 蛋白激酶c已经成为肿瘤研究领域的热点之一。研究发现,pkc α 磷酸化后活化多种蛋白分子，引起分化、增殖、胞膜转运、基因表达等一系列细胞反应。
药物或反义技术封闭pkc α 表达和活性, 可以抑制肿瘤细胞的生长、 促进凋亡、 抑制侵袭转移,以及增强对化疗药物的敏感性[9]。研究表明pkc α反义核酸可以 抑制胰腺癌、宫颈癌等肿瘤的表1 不同浓度的5 fu及其联合asodn 或pei asodn 对smmc 7721细胞增殖抑制作用的比较表2 不同浓度的as2o3 及其联合asodn或 pei asodn对smmc 7721细胞增殖抑制作用的比较(μmol/l)表3 不同浓度的 hcpt 及其联合asodn或pei asodn 对smmc 7721 细胞增殖抑制作用的比较 as为 asodn；
p a为pei asodn增殖[10 12]。因此，我们针对蛋白激酶c mrna的sd序 列上游非编码区设计合成反义核酸，阻断与pkc α相关的信号通路来抑制肿瘤生 长、促进其凋亡。
本实验选用肝癌常用药物5 fu、 as2o3及hcpt分别与pei asodn联合使用。
结果表明：化疗药物与pei asodn联合使用组的ic50最低, 分别将smmc 7721细 胞对5 fu、 as2o3、 hcpt的敏感性分别提高到单用化疗药物4.01、1.84、2.86倍， 这是由于asodn和化疗药物通过不同的机制共同作用于肝癌细胞,提高了肝癌细胞 对化疗药物的敏感性所致。金正均q值法[8]分析化疗药物与反义核酸的相互作用 表明: pei asodn与5 fu、hcpt联合使用,均表现为协同作用;与as2o3联合使用,仅 表现为相加作用，联合作用效果不如5 fu、hcpt明显，原因可能是带负电荷的 asodn增加了细胞膜外的电负性，影响了细胞对as2o3的摄入。而线性pei作为一种 高效、低毒的阳离子聚合物,能和dna形成中性或者带正电的复合物,即pei–asodn， 不仅介导asodn的摄入，而且通过中和部分细胞膜外的负电荷来促进化疗药的摄 入，通过不同的机制共同作用肝癌细胞，抑制生长、促进凋亡。
肝癌属于对化疗敏感性差、耐药性强的恶性肿瘤,而肝癌患者常患肝硬化 和慢性肝炎,肝功能差,不易耐受长期、大剂量的化疗。本实验通过联合使用化疗 药物和pei asodn，既能减少反义核酸的使用量,又可减少化疗药物的剂量,对于肝 癌治疗中减少药物的毒副作用,增强化疗药物的疗效有很好的效果。