HSVsup2;TK与ILsup2;2共表达真核载体的构建及其在
HSVsup2;TK与ILsup2;2共表达真核载体的构建及其在 【摘要】 目的 构建含有自杀基因单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv²tk)和人类 细胞因子白细胞介素²2(il²2)的联合表达质粒载体并观察其在人类肺腺癌细胞系 a549细胞中的表达。方法 设计、合成多克隆位点（mcs）插入到质粒psnav中,然 后分别从其他不同的质粒剪切片段hsv²tk、内部核糖体进入位点(ires)、il²2并依次 接入到mcs中，最终得到目的质粒psnav²tk²ires²il2(pmtⅱ)。目的质粒经酶切、dna 测序鉴定正确后，转染到a549细胞中。用rt²pcr方法、elisa法检测转染后细胞目的 基因的转录和表达；进一步倒置显微镜观察、mtt法检测更昔洛(gcv)对转然后细 胞的杀伤作用。结果 经酶切、dna测序、rt²pcr法和elisa法鉴定，双基因真核表达 载体pmtⅱ序列正确并能有效表达。进一步倒置显微镜观察和mtt法检测表明 hsv²tk/gcv自杀基因系统对a549细胞有明显的杀伤作用。结论 成功构建了pmtⅱ 真核表达载体，并观察了其对a549细胞的杀伤效应，为进一步研究hsv²tk/gcv联 合il²2基因治疗肺癌提供实验基础。
【关键词】 肺癌 基因治疗 单纯疱疹病毒胸苷激酶 (hsv²tk) il²2 0 引言 肺癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率逐年上升，在我国城市 人口中，它的病死率居各类恶性肿瘤之首。WWw.133229.COm如何进一步提高 治疗效果，降低死亡率一直是人们研究的重要课题。单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔 洛韦自杀基因系统(hsv²tk/gcv)以其具有的自杀效应在很多肿瘤的治疗研究中都 显示了有效的作用，尤以其独特的“旁观者效应”受到广大研究者的青睐，在针对 肺癌方面也有一定的治疗作用[1] 。但是肺癌的发生、发展是一个多步骤、多基 因参与的过程，而且不同组织类型肺癌细胞其自身生物学特性也存在很大差异， 因而国内外有学者提出单一的基因治疗对肺癌细胞的杀伤作用有限[2²3]，宜采用 联合治疗来提高有效性。近些年肿瘤的th1/th2免疫反应状态也是国内外研究的热 点之一，有文献报道在肺癌患者体内存在thl/th2细胞因子的平衡失调,发生了th1 向th2的异常漂移, 存在il²2等th1细胞因子分泌的不足[4²6]。而且临床上单独应用 il²2治疗肺癌及恶性胸水也显示了一定的治疗作用[7]。基于以上的理论和实验基础， 联合hsv²tk和il²2的双基因治疗有可能提高单基因治疗的效果。在本实验中，我们 构建了含有hsv²tk与il²2双治疗基因的真核表达载体，并初步观察了它在体外对非 小细胞肺癌株a549的杀伤效应，为进一步基因治疗研究奠定实验基础。1 材料和方法 1.1 材料 腺相关病毒载体psnav购自北京本元正阳生物有限公司；
psc11tk、 pcdnail²2为美国梅尔医学院石长信博士惠赠；
pires²eyfp为加拿大多伦多大学温晓 燕博士惠赠；
肺腺癌细胞系a549细胞，大肠杆菌dh5α为本室保存；
质粒提取试剂 盒、胶回收试剂盒、dna连接酶试剂盒、去磷酸化酶试剂盒均为takara公司（日本） 产品；
trizol试剂、lipofectamine2000为invitrogen公司（美国）产品；
各种限制性 内切酶为fermentas公司（美国）产品、taqdna聚合购自赛百胜公司（上海）；
逆 转录酶、rna酶抑制剂为promega公司产品（美国）；
gcv为湖南五洲通制药有限 公司产品；
elisa试剂盒购自上海西塘(进口分装)，胎牛血清为杭州四季青公司产 品。mcs序列、引物序列以及基因测序由上海生工、上海博亚生物工程有限公司 完成。
1.2 方法 1.2.1 psnav²tk²ires²il2载体的构建 psnav本身cmv启动子后的限制性内 切酶位点较少，根据插入片段所需内切酶设计、合成mcs，插入载体中。从其他 质粒中剪切需要的片段hsv²tk、ires（其前接有一段增强表达的ivs序列）、il²2并 按不同的酶切位点依次插入mcs多克隆位点中，得到最终目的质粒 psnav²tk²ires²il2(pmtⅱ)，酶切鉴定正确后送公司测序。在此构建过程中同时可获 得只含有hsv²tk片段的对照质粒psnav²tk(pmt)。
目的质粒构建流程如图1所示：
图1 psnav²tk²ires²il2( pmtⅱ)的构建流程（略） fig 1 construction of psnav²tk²ires²il2( pmtⅱ) 1.2.2 细胞培养及基因瞬时转染 细胞生长于含10％胎牛血清的dmem 的培养基中，在37℃、5％co2饱和湿度的温箱中培养。细胞分为三组，每组三孔：
（1）a549/pmtⅱ组，转染质粒pmtⅱ；
（2）a549/pmt组，转染质粒pmt；
（3）a549 组,未转染质粒。每个实验重复三次。转染前一天以105细胞接种于24孔板。待细 胞生长达到90%融合时，按脂质体lipofectamine2000操作说明书转染质粒。转染 时细胞换无血清培养基，dna（μg）与脂质体（μl）按预实验所得最佳比例1∶1 混合后转染。6h后，换完全培养基（含10%胎牛血清）继续培养，48h后，进行 后续检测试验。1.2.3 rt²pcr法检测hsv²tk基因与il²2基因mrna的转录 以trizol试剂提取 细胞总rna、再逆转录得到cdna，再经过pcr扩增出目的片段。引物序列见表1。pcr 反应条件：94℃预变性5min，94℃解链30s、57℃退火30s、72℃延伸1min，循环 30次，72℃总延伸10min，4℃终止反应。取5μl 的pcr产物经2%琼脂糖凝胶电泳 分析结果。用柯达凝胶分析软件分析电泳条带的光密度。
表1 pcr引物序列及扩增片段大小（略） tab 1 primer sequence of target genes 1.2.4 elisa法检测il²2的分泌 收集上述细胞的培养上清，每孔细胞上清 设三个复孔，按照elisa试剂盒的说明书进行检测。
1.2.5 gcv作用后细胞生长状况的测定 将a549细胞按5×103/孔接种于 96孔板,分组同上，次日将pmtⅱ和pmt分别转染细胞，转染步骤同上，转染36h后， gcv浓度按照0、1、10、50和100mg/l依次加入细胞中,每个浓度设3个复孔。每天 更换加药培养基，并观察细胞的形态学变化。作用120h后，加入5g/l mtt 10μl， 37℃作用4h，去上清，加入dmso 150μl，置摇箱中轻摇混匀后于490nm测吸光值。
细胞存活率按下式计算：细胞存活率（％）=a实验组/a对照组×100%(以gcv浓度 0mg/l为对照组)。
1.3 统计学方法 所有数据均以±s表示，用spss 13.0统计软件包处理，多组间均数比较采 用单因素方差分析，均数间的两两比较采用q检验，以p0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 pmtⅱ 的酶切、测序鉴定 重组质粒酶切片段大小与理论值相一致，测序结果提示与pubmed上所 提供的基因序列相同。
2.2 rt²pcr检测hsv²tk基因与il²2基因mrna的转录结果如图2所示，a549/pmtⅱ组、a549/pmt组, 均可检测到hsv²tk基因的 pcr产物，而a549组无此条带。三组均可检测到il²2的pcr产物。以gapdh为内参， 采用半定量rt²pcr方法测定il²2的转录水平变化，结果显示a549/pmtⅱ组转染质粒 pmtⅱ 48h后与其他两组相比il²2 mrna水平均升高（p0.05），其他两组相比差异 无统计学意义（p0.05）。
1: 100bp dna marker;
2: a549组(198bpgapdh and 127bpil²2);3: a549/pmt 组(302 bptk,198bpgapdh and 127bpil²2);4: a549/pmtⅱ组(302 bptk,198bpgapdh and 127bpil²2) 图2 hsv²tk与il²2 rt²pcr终产物电泳分析（略） fig 2 electrophoretic analysis of the hsv²tk and il²2 rt²pcr final products 2.3 elisa法检测各组细胞上清中il²2的分泌 a549/pmtⅱ组il²2分泌量显著高于a549/pmt组和a549组(p0.05)，后两组相 比差异无统计学意义(p0.05)，见图3。
图3 三组细胞培养上清中il²2水平 （略） fig 3 the level of secreted il²2 among the three groups 2.4 倒置显微镜下观察自杀基因对细胞的杀伤的形态学变化 倒置显微镜下观察，a549/pmtⅱ组细胞密度随gcv浓度的增高和作用时 间增长而逐步减小，gcv 10mg/l以上作用120h的各复孔均见细胞呈不规则形，多 角形，甚至变圆，胞膜皱缩，部分细胞脱落悬浮，大量细胞碎片产生，部分细胞 核染色质凝集，有调亡小体产生，gcv 100mg/l组作用120h镜下几乎不见梭形存活 细胞。a549/pmt组经不同浓度gcv作用后也表现出相同的效应。而gcv作用于a549 组则无此效应，见图4。
a：a549；
b：a549/pmtⅱ gcv 0 mg/l；
c：a549/pmtⅱ gcv 1mg/l；
d：
a549/pmtⅱ gcv 10mg/l；
e：a549/pmtⅱ gcv 50mg/l；
f：a549/pmtⅱ gcv 100mg/l 图4 gcv作用120h后对a549/pmtⅱ细胞的杀伤效应 (×100) （略） fig 4 cytotoxicity of gcv on a549/pmtⅱ for 120h(×100)2.5 mtt测定细胞的存活率 随着gcv剂量加大，a549/pmtⅱ、a549/pmt存活率呈逐渐下降趋势，具有 一定的剂量依赖效应。作为对照的野生型a549剂量达到10mg/l仍然没有明显的影 响，此剂量时hsv²tk阳性细胞的抑制率已经达到了66％(a549/pmt)、68％(a549/pmt ⅱ)。在野生型a549细胞中，浓度为100mg/l时才表现出对细胞的抑制效应，见图5。
图5 gcv作用120h后三组细胞的存活率（略） fig 5 the survival rate of cells treated by gcv for 120 h 3 讨论 hsv²tk/gcv自杀基因系统目前已经用于多种肿瘤的治疗研究。但单独应 用hsv²tk/gcv系统尚存在不足，如仅针对分裂期细胞，杀伤效应有限，缺乏靶向 性，肿瘤内部用药对远处转移肿瘤无效等。il²2通过激活机体的免疫系统不仅能 杀伤肿瘤细胞提高治疗效果，而且还通过增强免疫细胞对肿瘤抗原的提呈能力对 远处转移肿瘤细胞达到杀灭作用，同时可以以负反馈的方式杀灭携带有目的基因 的肿瘤细胞而调节基因的表达水平，从而限制自杀基因对周围正常细胞的杀伤作 用以及过度炎症反应的发生等。hsv²tk和il²2在杀瘤作用方面存在一定的互补性， 因而成为基因联合治疗的新研究热点之一。国内外各学者已经对某些类型的肿瘤 进行了其联合治疗的研究，如甲状腺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等[8²10]。barzon 等 [8]构建含hsv²tk和il²2两种基因的重组逆转录病毒载体,用于甲状腺癌细胞株 及裸鼠移植瘤模型。结果显示：对于分化甲癌联用双基因与单用il²2相比瘤体可 减小80％，而对间变性甲状腺肿瘤，瘤体可达到完全消除；
而且他们在此基础上 对两例晚期甲癌患者进行了临床治疗研究[9]，在试验中可观察到患者外周血th1 细胞因子表达的增加以及肿瘤实体中坏死灶的形成。但国内外尚未有两者联合共 表达治疗肺癌的报道，因而本试验针对肺癌展开研究。
实验中，我们首先构建了pmtⅱ质粒。该真核表达质粒携带有hsv²tk基因 和人il²2cdna，它们通过ires联接，因而可以在一个转录单位内共转录，从而实现 双基因干预的目的。通过经酶切、dna测序鉴定证实pmtⅱ质粒序列正确。将质粒 转染细胞，进一步通过rt²pcr对细胞内hsv²tk与il²2 的mrna进行检测，证实了pmt ⅱ真核表达载体构建成功。为了验证载体的功能，我们进行了进一步的实验。本研究中，目的质粒 转染a549细胞后，可以看到在细胞的生长抑制试验中，gcv对转染有hsv²tk基因的 两组a549细胞均有明显的生长抑制作用，而且呈一定的浓度依赖效应，而未转染 基因的细胞，只有gcv浓度达到100mg/l时才表现出对细胞生长的抑制。hsv²tk/gcv 自杀基因系统旁观者效应的发挥需要细胞间的连接。在光镜观察中可以看到gcv 浓度在50mg/l、100mg/l作用120h时，细胞数大量减少，细胞间连接也随之大面 积减少，与此相对应，我们在mtt试验中，观察到在gcv浓度大于10mg/l时，此系 统对细胞的生长抑制趋势明显减缓，可见旁观者效应可能是hsv²tk/gcv系统发挥 自杀作用的主要途径。在光镜观察过程中，不同浓度的gcv作用72h时，各组细胞 间并没有出现肉眼可见的明显差异，这可能与hsv²tk/gcv系统对细胞的生长抑制 作用需要较长的时间才能显现有关[10]。
本实验用elisa法对质粒转染后的细胞上清中il²2的水平进行了检测，结 果发现3组细胞均能检测出有il²2的表达，但转染pmtⅱ质粒组显著高于另两组， 提示pmtⅱ质粒能表达il²2，说明双表达载体构建是成功的。对il²2蛋白抗瘤效应 的观察须在在体实验中进行，本实验尚未开展。
综上所述，本实验成功构建并验证了pmtⅱ双表达质粒，并初步观察了 hsv²tk/gcv系统在体外对肺癌细胞株的杀伤作用，为进一步在动物机体内研究 hsv²tk/gcv联合il²2基因治疗肺癌，以及应用腺相关病毒载体进行肺癌的基因治疗 奠定了实验基础。