研非复制性腺病毒携带AT2
研非复制性腺病毒携带AT2 0 引言 1975 年Kohler 和Milstein 首先报道，用细胞杂交技术，使经绵羊红细胞 (SRBC)免疫的小鼠的脾细胞，与小鼠的骨髓瘤细胞融合，并由此创建了第一个B 细胞杂交瘤细胞株，获得了抗SRBC 的单克隆抗体。他们首先创立了将能分泌特 异性抗体的B 淋巴细胞同无限繁殖的骨髓瘤细胞融合技术，为单克隆抗体的制 备奠定了基础。这是免疫学，乃至医学史上的一个里程碑。本医学检验论文来源 于专业代写医学论文的中国医学论文网，如有业务需求请咨询网站客服人员！ 单克隆抗体以特异性高、性质均一和针对特定靶点定向制备等诸多优点而 广泛应用于各种疾病的治疗，特别是在肿瘤领域内的应用备受关注。美国FDA 先 后批准了10 多个用于治疗肿瘤的抗体药物，都是全长抗体。虽然单克隆抗体在 肿瘤治疗中发挥了重要的作用，但全长单克隆抗体治疗肿瘤成本太高：治疗肿瘤 的抗体需要量极多且纯度要求高，目前的生物制药工艺难以满足市场的需求，大 规模、高密度的哺乳动物细胞培养技术是目前国际上的一大难题，这些均导致高 生产成本及昂贵的价格，一般患者难以承受。因此，本课题的目的是利用非增殖腺病毒作为载体携带全长抗体基因在体 内表达全长抗体，这样可以避免在体外用哺乳动物细胞表达抗体，以及纯化等复 杂而且昂贵的规程。AT2是一个对肿瘤有明显疗效的抗EGFR 单克隆抗体 Cetuximab。由于EGFR 在很多肿瘤中都有过量表达，在肿瘤的发生、生长、抗 药性和转移性中都起到了重要的作用。Cetuximab 对过量表达EGFR 的肿瘤有良 好的治疗作用，现已被批准用于头颈癌、直肠癌和肺癌的治疗，无论是单独使用 还是与其它药物联合应用都有很好的效果，只有很小的副作用，出现严重反应的 概率不及万分之一。Cetuximab 单抗应用其它肿瘤治疗的研究也在大力的开发中， 在肿瘤的治疗中有很大应用前景，但是由于其生产成本过高，国内普通患者难以 承担，而抗体基因治疗正好解决了这个问题。本研究根据人体内密码子的偏爱性 选择修改了部分氨基酸密码子，构建了修改密码子后的重组腺病毒载体。体外实 验表明，通过修改密码子后提高了抗体的表达量，通过Western 和IFN 实验检验， 无论修改密码子与否，重组腺病毒在293 细胞中表达的抗体与商品化的 Cetuximab 单抗相近的特性，分子量大小一致，与抗原EGFR 有很好的结合，说 明我们构建的载体表达的抗体是有活性的。
1. 材料和方法 1.2.1 细胞培养A431 细胞、SK-Br-3 细胞和293 细胞在5%CO2，37℃ 条件下培养，培养液为含10%FBS的DMEM。
腺病毒载体我们首先分别合成修改密码子前后的AT2 抗体基因的轻链及 重链，且在轻链及重链前面各自合成抗体的信号肽基因，用IRES 元件连接抗体 的轻链和重链基因，以实现AT2 抗体的重链和轻链的平衡性及完整性，经PCR 引入酶切位点后，逐步把重轻链基因装入载体pDC339 中。
2. 结果 腺病毒穿梭载体pDC339-AT2 和pDC339-NAT2 的酶切和PCR 鉴定结果。
用双夹心 ELISA法测定病毒抗体的表达量：Ad-AT2 与Ad-NAT2 相比的 表达量分别是：
25.2±5ng/ml 和285.3±5ng/ml，通过修改密码子较大的提高了抗体的表达 量。
3 讨论 治疗各种疾病、顽症中有巨大的优势，但是由于其自身的某些性质，加上目 前我们的生产抗体的技术和工艺，限制了抗体的应用。在当前的生产抗体的工艺 比较复杂，需要综合多项技术，工艺和技术都被少数公司垄断，而且抗体的需要 量也在增大，最后导致抗体的治疗成本极高。
为了降低成本和提高抗体治疗效果，基因治疗是一种新型有效的手段，我 们可以通过把全长抗体基因装入载体，通过载体带进体内，是抗体在体内表达。
这样既可以免去体外生产抗体众多复杂的过程，降低成本，又可以使抗体更好的 在体内持续作用，更好的到达组织。
因此，如何找到一个安全的，有效的载体是关键。腺病毒成为一个重要的 载体，由于我们对其研究得比较清楚，我们对其进行改造，删除负责病毒复制的 E1A 区以及其它多余的区域。
腺病毒作为载体应用于基因治疗中有众多优点，在目前的条件下，腺病毒载体相对于其它载体，更适合作为基因治疗的载体。
根据密码子的偏爱性，我们收集了高表达的氨基酸密码子，修改了部分抗 体基因的密码子，以此来提高抗体的表达量。经Western 鉴定和IFN 实验证明腺 病毒载体表达的抗体是完整和有活性的，特异性也很好，可以应用下一步的治疗 研究。